Yöntem makalesi

Mikrovasküler Endotel Hücre Tek Tabakası Boyunca Lenfosit Transgrasyonunun İncelenmesi

8 Temmuz 2025

Bu makalede

Özet

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Kaynak: Schulte-Mecklenbeck, A., et al., İnsan Kan-beyin Bariyerinin In Vitro Modeli Kullanılarak Lenfosit Ekstravazasyonunun Analizi. J. Vis. Uzm. (2017)

Bu video, bir kan-beyin bariyeri (BBB) endotel modeli boyunca lenfosit transgöçünün deneysel bir araştırmasını göstermektedir. İnsan beyni mikrovasküler endotel hücrelerinin (HBMEC'ler) tek tabakası in vitro olarak üretilir ve lenfositleri içeren periferik kan mononükleer hücreleri (PBMC'ler) monotabakaya eklenir. Hücreler daha sonra lenfosit transgöçüne izin vermek için inkübe edilir ve göç eden hücreler akış sitometrisi kullanılarak ölçülür.

Protokol

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

1. Hücre Kültürü Eklerinin Hazırlanması

  1. Hücre kültürü eklerinin kaplanması
    Önemli not: Hücre kültürü eklerinin zarına dokunmaktan kaçının.
    1. Her hücre kültürü ekine (Şekil 1A) ve 96 oyuklu düz tabanlı bir plakanın bir kuyusuna (optik kontrol kuyusu) 100 μL fibronektin çözeltisi ekleyin. 37 °C'de en az 3 saat inkübe edin. İnkübasyondan sonra fibronektin çözeltisini aspire edin.
    2. Hücre kültürü eklerine ve optik kontrol kuyusuna 100 μL HBMEC süspansiyonu ekleyin. Hücre kültürü eklerinin alt bölmesine 600 μl endotel hücre ortamı-bazal (ECM-b) ortamı ekleyin. Bariyer bütünlüğüne ulaşılana kadar 37 ° C /% 5 CO2'de 3 - 4 gün inkübe edin (Şekil 1B), optik kontrol kuyusunda HBMEC'nin mikroskobik değerlendirmesi ile hücre büyümesini kontrol edin.
      not: Dört günden fazla hücre büyümesi önerilmez.

2. Migrasyon Testi

  1. Periferik kan mononükleer hücrelerinin (PBMC) hazırlanması.
    1. 15 mL'lik bir santrifüj tüpüne 10 mL Roswell Park Memorial Institute (RPMI) ortamı ekleyin ve 200 μL B27 takviyesi ekleyin. PBMC ve santrifüj hücrelerini 5 dakika boyunca 300 x g'da sayın. PBMC'yi 5 x 106 hücre / mL RPMI / B27 nihai konsantrasyonuna yeniden askıya alın.
  2. Migrasyon testinin ayarlanması
    1. Alt bölmeden ortamı aspire edin, ardından birleşik HBMEC tek katmanları içeren hücre kültürü eklerinin üst bölmesi gelir (Şekil 1A). Donör başına, hücre kültürü eklerine ve ayrıca her biri 24 oyuklu bir plakanın bir kuyucuğuna (in vitro kontrol) 100 μL PBMC süspansiyonu ekleyin.
    2. Hücre kültürü eklerinin alt bölmesine 600 μL RPMI/B27 ve in vitro kontrolün PBMC'sine 500 μL ekleyin ve 37 °C /% 5 CO2'de 6 saat inkübe edin.
  3. Taşınan PBMC'nin toplanması
    1. Forseps kullanarak hücre kültürü ekini çıkarın ve zara dokunmadan altını 400 μL fosfat tamponlu salin (PBS) ile dikkatlice durulayın. Hücre kültürü ekini atın.
    2. Hücre kültürü ekinin alt bölmesine ve ayrıca in vitro kontrole 20 μL akış sayılı florosfer (yaklaşık 1.000 boncuk / μL) ekleyin ve iyice karıştırın. Elde edilen 1 mL PBMC süspansiyonunu akış sitometri tüplerine aktarın.

3. Akış Sitometrisi

  1. Numune hazırlama
    1. PBMC'yi oda sıcaklığında 5 dakika boyunca 300 x g'da santrifüjleyin.
    2. Örnek başına 100 μL akış sitometri tamponuna (PBS /% 1 sığır serum albümini [BSA] / 2 mM etilendiamintetraasetik asit [EDTA]) florokrom konjuge antikorlar ekleyerek antikor çözeltisi hazırlayın. Aşağıda sunulan sonuçlar için 1 μL CD4-FITC (farklılaşma kümesi 4-floresein izotiyosiyanat), 1 μL CD3-PerCP / Cy5.5 (peridinin klorofil proteini / siyanin 5. 5), 1 μL CD56-PC7 (fikoeritrin siyanin 7), 1 μL CD8-A700 (Alexa flor 700) ve 1 μL CD16-A750 (Alexa flor 750) kullanıldı.
    3. PBMC'yi 100 μL antikor çözeltisinde yeniden süspanse edin ve 4 ° C'de 30 dakika inkübe edin.
    4. 250 μL akış sitometrisi tamponu ekleyin ve 5 dakika boyunca 300 x g'da santrifüjleyin.

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Sonuçlar

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

figure-results-1
Şekil 1: NK hücresi Alt Kümelerinin İltihapsız ve İltihaplı HBMEC Tek Katmanları Boyunca Diferansiyel Migrasyonu. Bir.Transwell eklerinin bir resmi (solda) ve deney düzeneğinin çizimi (sağda). B. HBMEC bariyer fonksiyonlarının doğrulanması. Solda: 3 gün boyunca yetiştirilen HBMEC üzerinde tavşan anti-insan zonula occludens-1 (ZO-1, abcam, 1:200) ve keçi anti-tavşan immünoglobulini G/s...

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Açıklamalar

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
Herhangi bir çıkar çatışması beyan edilmemiştir.

Malzemeler

Bu makalede kullanılan malzemelerin listesi
AdŞirketKatalog numarasıYorumlar
PBSGibco14190-094CaCl2 veya MgCl2 olmadan
Fibronektin 1mg/mLSigmaF1141-5MGsığır plazmasından
HBMECScienCell1000
HBMECPelobiyoteknolojiPB-H-6023
ECM-bScienCell1001-b
FBSScienCell1001-b
Penisilin/StreptomisinScienCell1001-b
Endotel hücre büyüme takviyesiScienCell1001-b
TranswellCorning3472 şeffaf, 6,5 mm çap, 3,0μm gözenek boyutu
96 kuyulu düz tabanlı plakaCorning3596
B27Gibco17504-04450x konsantre
48 kuyulu plakaCorning3526
RPMI 1640Gibco61870-010
Akış Sayısı FlorosferleriBeckman Coulter7547053
Na-EDTASigmaE5134
BSASigmaA2153
CD3-PerCP/Cy5.5Biyoefsane300430clone UCHT1
CD56-PC7Beckman CoulterA21692klon N901
CD16-A750Beckman CoulterA66330klon 3G8
CD4-FITCBiyoefsane300506clone RPA-T4
CD8-A700Beckman CoulterA66332klon B9.11

Yeniden basım ve izinler

Bu JoVE makalesinin metnini veya şekillerini yeniden kullanmak için izin iste

İzin iste

Etiketler

Kan beyin BariyeriPeriferik Kan Monon kleer H creleriAk SitometrisiTranswell nsertlerH cre K lt rFloresan MikrobilyelerAntikor EtiketlemeH cre Kantifikasyonu

İlgili makaleler