Hayvan örneklerini içeren tüm prosedürler, uygun hayvan etik inceleme komitesi tarafından gözden geçirilmiş ve onaylanmıştır.
1. Enfarktüs bölgesinin belirlenmesi
- Orta serebral arter tıkanıklığından (MCAO) 24 saat sonra enfarktüs bölgesini (IZ) ölçün.
NOT: Kilolarının 'sinden fazlasını kaybeden veya nöbet veya hemipleji geliştiren sıçanlar deneyden çıkarılmıştır.
- Sıçan kendiliğinden nefes almayı bırakana kadar, solunan gaz karışımını% 20 oksijen ve% 80 karbondioksit ile değiştirerek sıçanı ötenazi yapın.
- Makas ve cerrahi forseps kullanarak göğüs kafesinin altından karın duvarından 5-6 cm'lik bir kesi ile göğsü açın.
- Makas ve cerrahi forseps ile göğüs kafesinin tüm uzunluğu boyunca diyafram kesisi yapın.
- Akciğerleri dikkatlice yerinden ederek, göğüs kafesini sağ ve sol taraflarda köprücük kemiğine kadar kesin.
- Kalbin sol ventrikülünden 200 mL normal salin ile perfüz.
- Kalbin sağ atriyumunu makasla delin veya kesin.
- Bir giyotin kullanarak dekapitasyon yapın ve beyin dokusunu toplayın.
- İris makası kullanarak, foramen magnumdan her iki tarafta arka kafatası yüzeyinin distal kenarına kadar kesin.
- Koku soğancıklarını, kafatasının ventral yüzeyi ve dorsal yüzeyi boyunca sinir bağlantılarını beyinden ayırın.
- Beyni kafadan çıkarın.
- .009" paslanmaz çelik, kaplamasız, tek kenarlı tıraş bıçağı ile 2 mm kalınlığında yatay kesitler oluşturarak 6 beyin dilimi üretin.
- % 0.05 TTC'de 37 ° C'de 30 dakika inkübe edin.
- Beyin dokusunu mikroskop slaytlarına yerleştirin ve bu 6 beyin diliminin 1600x1600 dpi çözünürlükte optik taramasını yapın (örneğin Şekil 1'ye bakın).
- Kanal Karıştırıcı işlevini (Görüntü > Ayarlamaları > Kanal Karıştırıcı) kullanarak bir fotoğraf düzenleyiciyle (ör. Adobe Photoshop CS2) mavi bir filtre ekleyin ve görüntüyü bir JPEG dosya formatı olarak kaydedin.
NOT: Mavi filtreyi uyguladıktan sonra görüntü gri tonlamalı görünecektir.
- Kaydedilen görüntüyü ImageJ 1.37v içinde açın.
NOT: Bu bilgisayar programı, siyah veya beyaz olan pikselleri ayırmak ve hesaplamak için bir eşik işlevi kullanır (bkz. Şekil 2).
- Görüntünün 6 beyin diliminin her biri için, ana menüdeki "çokgen seçimi" aracını kullanarak her yarım küreyi (sağ yaralı ipsilateral ve sol yaralanmamış kontralateral) ayrı bir görüntü dosyası olarak seçin ve kaydedin.
- ImageJ yazılımının ana menüsünden Image > Adjust > Threshold öğesini seçerek bir otomatik eşik işlevi kullanarak IZ'yi belirlemek için kesme değerini ayarlayın ve tek bir beyin setinin her yarım küresindeki piksel sayısını ölçün.
NOT: ImageJ yazılımında bu adım için makrolar kullanılabilir (kod için Ek belge 1 bölümüne bakın). Kesme, grinin gölgesine bağlı olarak hangi piksellerin beyaza dönüştürüleceğini ve hangilerinin siyaha dönüştürüleceğini belirlemek için kritik bir parametredir (örnek olarak bkz. Şekil 3 ve Şekil 4). ImageJ daha sonra IZ'yi belirlemek için beyaz ve siyah pikselleri karşılaştırır. Boyama protokolüne ve tarayıcı ayarlarına bağlı olarak, 0.220'lik sabit bir kesme değeri kullandık.
- İpsilateral ve Kontralateral Serebral Hemisfer Oranları (RICH) yöntemini kullanarak doku şişmesi için IZ düzeltme ölçümünü gerçekleştirin (Şekil 5'deki örneğe bakın).
NOT: Enfarktüs boyutu, kontralateral hemisferin yüzdesi olarak değerlendirilir.
2. Beyin ödeminin belirlenmesi
NOT: Beyin ödemi (BE) ölçümü için ImageJ 1.37v kullanın.
- MCAO'dan 24 saat sonra BE ölçün. BE'yi hesaplamak için, sol ve sağ yarım küre hacminden (birim olarak) gelen verileri kullanın.
- 1600x1600 dpi çözünürlükte optik tarama gerçekleştirin (örneğin bkz. Şekil 1).
- Beyin yarım kürelerini seçin ve yukarıda bölüm 1.17-1.19'da açıklandığı gibi ImageJ 1.37v ile BE'yi belirlemek için kesmeyi ayarlayın.
- BE alanını, aşağıdaki denklemi kullanarak RICH yöntemiyle hesaplanan, etkilenmemiş kontralateral hemisferin standart alanlarının yüzdesi olarak ifade edin (Şekil 5'deki örneğe bakın).
NOT: BE'nin derecesi, kontralateral hemisferin yüzdesi olarak değerlendirilir.
