Transendotelyal Elektrik Direncinin İn Vitro Kan-Beyin Bariyeri Modelinde Değerlendirilmesi

Özet

Kaynak: Kuzmanov, I., et al. Empedans Spektroskopisi Kullanılarak Kan-Beyin Bariyerinin İn Vitro Modeli: T Hücresi-Endotel Hücre Etkileşimine Odaklanma. J. Vis. Uzm. (2016)

Bu video, in vitro olarak fare beyni mikrovasküler endotel hücrelerinde transendotelyal elektrik direncini (TEER) değerlendirmek için bir yöntemi göstermektedir. Yüksek bir TEER değeri, sağlam endotel hücre bağlantılarını gösterirken, aktive edilmiş T hücrelerinin eklenmesi, bağlantı bariyerinin bozulmasını yansıtan TEER değerini düşürür.

Protokol

1. Transendotelyal Elektrik Direnci (TEER) Ölçümünün Ayarlanması ve Gerçekleştirilmesi

1. Transendotelyal elektrik direnci (TEER) cihazının 24 oyuklu modülünü laminer akış başlığının altına yerleştirin. Kapakları çıkarın ve forseps kullanarak cihaza birincil fare beyni mikrovasküler endotel hücreleri (MBMEC'ler) içeren ekleri yerleştirin.
2. Modül yuvalarının alt bölmesine 810 μl taze ortam pipetleyin: ek parça ile modül kuyusunun duvarı arasına dikkatlice yerleştirin.
3. Kapakları kapatın ve aleti inkübatöre yerleştirin. Enstrümanı bilgisayarına bağlayın; Enstrüman kontrol cihazını açın ve yazılımı açın.
4. Açılır pencerede 'yeni ölçüm'ü seçin. 'TEER'i göster' ve 'Ccl'yi göster' kutularını işaretleyin; Ardından 'başlat'a basın. İlk ölçümü tamamladıktan sonra, tüm TEER ve hücre katmanı kapasitansı (Ccl) değerlerini görmek için 'sonuçlar' sekmesinde 'tüm kuyuları kontrol et'i seçin.
5. Dosyayı kaydedin: Dosya>Farklı kaydet> 'dosyanızın adı'.
   NOT: TEER ve Ccl sürekli olarak otomatik bir şekilde ölçüldüğünden, değerlerini üç ila beş günlük bir süre boyunca izleyin. TEER'deki artış eksikliği ile görselleştirildiği gibi, hücre canlılığı yetersiz olmadıkça, ortamın değiştirilmesi gerekli değildir.
6. Ccl stabil olduğunda ve 1 μF/cm²'den düşük olduğunda ve TEER maksimum seviyesine ulaştığında MBMEC'leri T hücreleri ile birlikte kültürlemek için zaman noktasını seçin.
7. Mutlak TEER ve Ccl değerlerini dikkatlice inceleyin ve MBMEC'lerin yeterince birleşik tek tabaka geliştirmediği kuyuları, bu tür kuyuların işaretini kaldırarak hariç tutun.
8. Kuyuların geri kalanını gruplandırın: bir kuyuya sağ tıklayın ve 'yeni ortalama kuyuya kuyu ekle'yi seçin. Açılır pencerede adlandırın; Gruplandırılacak tüm bireysel kuyular için aynısını yapın.
9. Hepsinin ko-kültürden önce aynı başlangıç koşullarına sahip olduğunu doğrulamak için tüm ortalama kuyuları kontrol edin. Bazıları önemli ölçüde farklı mutlak TEER değerlerine veya TEER eğimlerine sahipse veya standart hatalar çok büyükse, gruplandırmayı yeniden yapın.
   NOT: Kuyuların optimal gruplandırılması, deney grupları içinde ve arasında TEER değerlerinde minimum değişiklik sağlar.
10. 'Deney' sekmesinde, 'duraklat'a basın, cihazın bağlantısını kesin ve inkübatörden çıkarın. Laminer akış başlığının altındaki kapakları çıkarın.
11. Spesifik sitokinler, antikorlar veya diğer maddeler olsun veya olmasın, önceden aktive edilmiş ve / veya saf T hücrelerini istenildiği gibi hazırlayın. Örneğin, saflaştırılmış doğal / düşük endotoksin (NA / LE) sıçan anti-fare interferon-gama (IFN-γ) antikoru (klon XGM1.2), TEER cihazının oyuğu başına 20 μg / ml'de hazırlanmış T hücreleri ile karıştırın.
    NOT: Granzim B inhibitörü gibi maddeler kullanılıyorsa, bunlar T hücresi stimülasyonunun başlangıcında T hücre kültürüne eklenir: örneğin, , Granzyme B İnhibitörü II (Calbiochem), dimetil sülfoksit (DMSO) içinde 10 μM'lik bir nihai konsantrasyonda izole edilmiş T hücreleri ile karıştırılır.
12. Ortamın bir kısmını ek parçadan (üst kuyu bölmesi) çıkarın. Example: 150 μl'yi dikkatlice pipetleyin (MBMEC tek tabakasını bozabileceğinden tüm ortamın çıkarılmasından kaçınılmalıdır).
13. 2 x 10⁵ hücre/insert içeren 150 μl ortamı dikkatlice pipetleyerek MBMEC'lere T hücreleri ekleyin.
    NOT: Önceden etkinleştirilmiş T hücrelerini toplarken, yalnızca patlatma Tripan Mavisi içermeyen hücreleri sayın.
14. Kapakları kapatın ve aleti tekrar inkübatöre yerleştirin. Cihazı yeniden bağlayın ve 'ölçüme devam et' düğmesine basın. 24 saat sonra, 'deney' sekmesinde 'durdur'a basın ve dosyayı kaydedin (Dosya>Kaydet).

Malzemeler

Bu makalede kullanılan malzemelerin listesi

Ad	Şirket	Katalog numarası	Yorumlar
cellZscope	nanoAnalytics GmbH	www.nanoanalytics.com	dahil: 24 kuyulu Hücre Modülü, Denetleyici, cellZscope yazılımı v2.2.2
Transwell membran ekleri - gözenek boyutu 0,4 μm	Corning	3470
Transwell membran ekleri - gözenek boyutu 3 μm	Corning	3472	T hücresi transmigrasyon testinden önce kalite kontrol olarak TEER ölçümü için
24 oyuklu hücre kültürü plakası	Greiner	650 180	düz tabanlı; MBMEC kültürü için
96 oyuklu hücre kültürü plakası	Yardımcı yıldız	3526	yuvarlak-alt; İmmün hücre kültürü için
Neubauer sayım odası	Marienfeld	MF-0640010	hücre sayımı için
İnsan plasentasından kollajen tip IV	Sigma	C5533
Sığır plazmasından elde edilen fibronektin	Sigma	F1141-5MG
DMEM (+ GlutaMAX)	Gibco	31966-021
Penisilin/Streptomisin	Sigma	P4333
Heparin	Sigma	H3393
İnsan Temel Fibroblast Büyüme Faktörü (bFGF)	PeproTech	100-18B
IMDM + %1 L-Glutamin	Gibco	21980-032	T hücre kültürü ortamı için
Rekombinant Murin IFN-γ	PeproTech	315-05	T hücresi transmigrasyon testleri için
Rekombinant Murin TNF-α	PeproTech	315-01A	T hücresi transmigrasyon testleri için
NA/LE saflaştırılmış anti-fare IFN-γ antikoru	BD Biyolojik Bilimler	554408	klonla; Önerilen nihai konsantrasyon: 20 μg/ml
Granzim B İnhibitörü II	Calbiochem	368055	önerilen nihai konsantrasyon: 10 μM
PE anti-fare CD4 antikoru	Biyoefsane	116005	RM4-4 klonu; T hücresi transmigrasyonunun analizi için
Tripan Mavisi çözeltisi, %0,4	Thermo Fisher Bilimsel	15250061	hücre sayımı için

ile PC Ana okuma olarak TEER ölçümü için MBMEC kaplama çözümü için MBMEC kaplama çözümü için MBMEC izolasyonu ve MBMEC kültür ortamı için MBMEC izolasyonu ve MBMEC kültür ortamı için MBMEC kültür ortamı için MBMEC kültür ortamı için XMG1.2'yi