Fare Beyninin Meyner Çekirdeği Basalis'teki Sinir Liflerinin İmmünohistokimyasal Boyanması

Özet

Kaynak: Singh, P., et al. Fare Beyninin Meynert'in Çekirdek Bazalisindeki Kolinerjik Lif Uzunluğunun Stereolojik Tahmini. J. Vis. Uzm. (2020)

Bu video, fare beyninin bölümlerinin Meynert bölgesinin çekirdek bazalisindeki kolinerjik liflerin immünohistokimyasal boyanmasını göstermektedir. Bölümler bloke edilir ve kolin asetiltransferaza karşı primer ile tedavi edilir, ardından biyotinile edilmiş sekonder antikorlar takip edilir. İkincil antikorlara bağlanan avidin-biotin-peroksidaz kompleksleri eklenir, ardından kromojenik substrat gelir. Kesitler daha sonra kurutulur ve mikroskop altında görselleştirmeden önce monte edilir.

Protokol

Hayvan örneklerini içeren tüm prosedürler, uygun hayvan etik inceleme komitesi tarafından gözden geçirilmiş ve onaylanmıştır.

1. Perfüzyon ve doku işleme

1. Ketamin (100 mg / kg) ve ksilazin (10 mg / kg) ile intraperitoneal enjeksiyon kullanarak fareleri uyuşturun. Devam etmeden önce yanıt eksikliğini doğrulamak için ayak parmaklarınızı sıkıştırın.
2. ~ 50 mL buz gibi soğuk 0.1M Dulbecco'nun fosfat tamponlu salini (DPBS) ile transkardiyal perfüz, ardından 0.1M fosfat tamponunda (PB) %4 paraformaldehit (PFA) gelir.
   DİKKAT: PFA toksiktir. PFA ile çalışırken kişisel koruyucu ekipman (KKD) kullanın.
3. Beyinleri çıkarın ve sabitleme sonrası için 24 saat boyunca 4 ° C'de 0.1 M PB'de% 4 PFA'ya daldırın. DPBS 3x ile yıkayın.
4. Gece boyunca 0.1 DPBS'de% 15 sükroz çözeltisine ve ardından 4 ° C'de 48 saat daha 0.1 M DPBS'de% 30 sükroz çözeltisine geçin.
5. Dokuyu sükroz çözeltisinden çıkarın ve -20 ° C'lik bir sıcaklığa önceden ayarlanmış bir kriyotom odasında dondurun. Dondurulmuş numuneler, kesitlere ayrılana kadar -80 ° C'de kapalı tüplerde saklanabilir.
6. Dokuları optimum kesme sıcaklığı gömme ortamına gömün (Malzeme Tablosuna bakınız) ve bir numune diskine monte edin. Bir kriyotom kullanarak bir koronal düzlemde seri 30 μm kalınlığında kesitler kesin ve sonuç olarak tüm bölümleri kriyoprotektan çözeltisi (%30 gliserol, %30 etilen glikol, %40 DPBS; Şekil 1A–C). -20 °C dondurucuda saklayın.
   NOT: Mümkün olduğunda daha kalın bölümler (örn. 50 μm) tercih edilir. Bölümlerin kesim sırasında tutulduğundan ve tüm bölümlerin tamamen kriyoprotektan içinde olduğundan emin olun. Bölümleri toplamak için 24 kuyulu plakaya alternatif olarak 96 oyuklu bir plaka kullanılabilir.
7. Buharlaşmayı ve kurumayı önlemek için kuyuları plaka kapatıcı ile örtün. Plakaları daha fazla kullanana kadar -20 °C'de saklayın. -20 °C'de saklanan kesitler, kolin asetiltransferaz (ChAT) immünohistokimyası için birkaç ay stabildir.

2. IHC için sistematik bölüm seçimi

NOT: Kabul edilebilir bir hata katsayısı (CE) elde etmek için gereken toplam bölüm sayısını bilmek için bir pilot çalışma yapılmalıdır. CE değeri, numune alma prosedüründeki toplam hata miktarının bir ifadesidir. En düşük değer minimum hatayı temsil eder ve 0,1'den düşük bir CE değeri burada kullanılan yazılım tarafından kabul edilebilir olarak kabul edilir (bkz. Malzeme Tablosu).

1. Morfolojik özellikleri Franklin ve Paxinos gibi standart bir fare beyin atlası ile karşılaştırarak her beynin ilk ve son bölümlerini belirleyin. Meynert veya NBM'nin çekirdek bazalisi -0.0 mm'de başlar ve -1.6 mm'de biter. Bu nedenle, yaklaşık 50 bölüm NBM içerir. Toplam kesit sayısı stereoloji sırasında gerekli olan parametrelerden biridir. Her 8. bölümün seçimi (SSF = 1/8) analiz için toplam 6-7 bölüm verdi ve pilot çalışmamızda hem hacim tahmini hem de lif uzunluğu tahmini için kabul edilebilir bir CE verdi.
2. Rastgele olarak ilk sekiz bölümden biriyle başlayın ve daha sonra NBM içeren son arka bölüme kadar her 8. bölümde bir sistematik olarak numune alın (Şekil 1C).

3. İmmünohistokimya

1. Dondurularak saklanan bölümleri kriyoprotektan içinde oda sıcaklığına ve ardından 6 oyuklu plakada 0.1M fosfat tamponuna (PB) aktarın.
2. PB'de 3 kez yıkayın.
3. Metanolde% 0.3 H₂O₂ içinde 15 dakika inkübe edin.
4. Tris tamponlu tuzlu su içinde (TBS) 3 kez yıkayın.
5. TBS'de% 0.25 Triton X-100'de 30 dakika inkübe edin.
6. TBS'de% 0.1 Triton X-100'de% 10 normal sığır serumu (NBS) ile 30 dakika boyunca bloklayın.
7. 4 ° C'de 48 saat boyunca% 0.1 Triton X-100 ve% 1 NBS ile TBS'de 1: 1.000 seyreltme keçi anti-insan ChAT birincil antikorları (Malzeme Tablosuna bakınız) ile inkübe edin.
8. TBS'de 3 kez oda sıcaklığında yıkayın. Diğer tüm inkübasyon ve yıkama işlemlerini oda sıcaklığında gerçekleştirin.
9. Biyotinile edilmiş sığır anti-keçi ikincil antikoru ile 1 saat inkübe edin (Malzeme Tablosuna bakınız).
10. TBS'de 3 kez yıkayın.
11. Avidin-biotin-peroksidaz kompleksi ile inkübe edin (bkz. Malzeme Tablosu).
12. TBS'de 3 kez yıkayın.
13. Üreticinin tavsiyelerine göre gelişmiş bir DAB peroksidaz substrat çözeltisi (Malzeme Tablosuna bakınız) kullanarak geliştirin.
    DİKKAT: DAB şüpheli bir kanserojendir. Temas ve solunması ile toksiktir. DAB ile çalışırken KKD kullanın.
14. Bölümü birkaç kez damıtılmış suyla yıkayın ve Tris pH = 7.6'da tutun.
15. Bölümleri jelatinleştirilmiş slaytların üzerine monte edin. Bir dokudan alınan tüm bölümler aynı slayta yerleştirilebilir. Bölümleri havayla kurutun, her biri %70, %90, %95 ve %100 etanol ile 5 dakika 2 kez kurutun ve ardından bölümleri iki adet 10 dakikalık ksilen yıkama ile temizleyin. Bölümleri bir montaj ortamı kullanarak lamel yapın (bkz. Malzeme Tablosu).
    NOT: Dehidrasyon ve temizleme işlem süresi, bölümlerin kalınlığını etkiler. Bu nedenle, tüm bölümler için aynı koşullar kullanılmalıdır. Mevcut çalışmada, nihai kalınlık için ortalama değer 21.11 ± 0.45 μm idi.
16. Çeker ocaktaki bölümleri kuruması için saklayın. Kuru bölümler stereoloji için hazırdır.

Sonuçlar

Şekil 1: Bu çalışmada kullanılan doku işleme ve örneklemenin gösterimi. Numune hazırlama ve numune alma. (A) Beyincik ve koku soğancığı, numune diskine monte edilmeden önce çıkarılır. (B) Kesit kesme için beynin numune diski üzerindeki oryantasyonu. Bir yarım küre üzerinde sığ bir uzunlamasına kesi (bir çizgi ile işaretlenmiş), beynin bölümlerdeki tarafını tanımlamaya yardımcı olur. (C) 24 oyuklu pla...

Malzemeler

Bu makalede kullanılan malzemelerin listesi

Ad	Şirket	Katalog numarası	Yorumlar
ABC kiti	Vektör Laboratuvarları	PK6100
Anti-ChAT Antikoru	Millipore, MA, Amerika Birleşik Devletleri	AB144P
Sığır anti-keçi IgG-B	Santacruz Biyoteknoloji	SC-2347
Sığır Serumu, Yetişkin	Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, Amerika Birleşik Devletleri	B9433
Kriyostat	Lieca Microsystems, Buffalo Grove, IL, ABD
Dulbecco'nun Fosfat Tamponlu Tuzlu Suyu	Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, Amerika Birleşik Devletleri	D5652
Etilen Glikol	Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, Amerika Birleşik Devletleri	324558
Gliserol	Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, Amerika Birleşik Devletleri	G2025
Hidrojen Peroksit	Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, Amerika Birleşik Devletleri	H1009
Immpact-DAB kiti	Vektör Laboratuvarları	SK4105	Geliştirilmiş DAB peroksidaz substrat çözeltisi
Ketamin	Westward Pharmaceuticals, NJ, ABD	0143-9509-01
Mikroskop	Lieca Microsystems, Buffalo Grove, IL, ABD	AF6000	Motorlu sahne ve IMI-tech renkli dijital kamera ile donatılmıştır
Optimum kesme sıcaklığı (O.C.T.) gömme ortamı	Elektron Mikroskobu Bilimleri, PA, ABD	62550-12
Paraformaldehit	Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, Amerika Birleşik Devletleri	P6148
Permount montaj ortamı	Elektron Mikroskobu Bilimleri, PA, ABD	17986-01
Triton X-100	Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, Amerika Birleşik Devletleri	T8787
Trizma Tabanı	Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, Amerika Birleşik Devletleri	T1503	Tris tabanı
Trizma hidroklorür	Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, Amerika Birleşik Devletleri	T5941	Tris hidroklorür
Ksilazin	Bayer, Leverkusen, Almanya	Rompun
Ksilenler, Histolojik derece	Sigma-Aldrich, St. Louis, MO	534056