$$\rightleftharpoonup{xx}$$
$$\longleftharp{xx}$$,
$$\longrightharp{xx}$$,
1. Sinaptozomal Dopamin Alımı
NOT: Bu protokol iki beynin paralel değerlendirmesi içindir, ancak aynı zamanda paralel olarak dört beyinle sinaptozomal dopamin (DA) alım deneyleri gerçekleştirmek için de başarıyla kullanılabilir.
- Hazırlıklar
- Tablo 1 başına 48 adet 1,5 mL mikro santrifüj tüpü etiketleyin (her beyin için 24 adet). Örnekler arasında karışıklığı önlemek için her beyne ait tüpler için farklı renkler kullanın.
- 51 sintilasyon tüpü # 1-51'i etiketleyin.
- Fosfat tamponlu salini (PBS) buzun üzerine yerleştirin. Bu, beyinleri soğuk tutmak için kullanılacaktır.
- 4 °C'ye kadar soğumasını sağlamak için santrifüjü açın.
- Sinaptozomal preparat sırasında tam doku ağırlığını elde etmek için iki mikro santrifüj tüpünü önceden tartın (bölüm 2.6).
- 4 mM HEPES ve 0.32 M sükrozu karıştırarak homojenizasyon tamponu hazırlayın. PH'ı 7.4'e ayarlayın ve buz üzerinde tutun.
NOT: Homojenizasyon tamponu -20 °C'de alikotlarda bekletilebilir ve deney günü çözdürülebilir.
- Aşağıdakileri birleştirerek alım tamponu hazırlayın: 25 mM HEPES, 120 mM NaCl, 5 mM KCl, 1.2 mM CaCl2, 1.2 mM MgSO4, 1 mM askorbik asit (0.194 g/L), 5 mM D-glikoz (0.991 g/L). NaOH ile pH'ı 7.4'e ayarlayın (yaklaşık 130 mM'lik bir sodyum konsantrasyonuna yol açar) ve buz üzerinde tutun.
NOT: 2 beyin için 1500 mL alım tamponu hazırlayın. Alım tamponunu 4 ° C'de tutulan askorbik asit ve glikoz olmadan 10x stok çözeltisi olarak hazırlayın. Askorbik asit ve glikoz ile takviye ederek günde taze 1x çalışma solüsyonu hazırlayın. NaOH ile pH'ı 7.4'e ayarlayın.
- Aşağıdakileri birleştirerek alım tamponu + ligandı hazırlayın: 25 mM HEPES, 120 mM NaCl, 5 mM KCl, 1.2 mM CaCl2, 1.2 mM MgSO4, 1 mM askorbik asit (0.194 g/L), 5 mM D-glikoz (0.991 g/L), 1 μM pargyline, 100 nM desipramin, 10 nM Katekol-O-metil-transferaz (COMT) inhibitörü. NaOH ile pH 7.4'e ayarlayın ve buz üzerinde tutun.
NOT: 50 mL alım tamponu kullanın ve ligand ekleyin. Monoamin oksidaz (MAO) yoluyla oksidasyon yoluyla DA'nın bozulmasını önlemeye yardımcı olmak için pargyline eklenir. DA'nın (genel olarak katekolaminler) COMT yoluyla bozulmasını önlemek için COMT inhibitörü (RO-41-0960) eklenir. Desipramin, norepinefrin ve serotonin taşıyıcıları yoluyla alımı inhibe etmek ve böylece alım sonuçlarını dopamin taşıyıcısı (DAT) için spesifik hale getirmek için eklenir.
- Aşağıdakileri birleştirerek alım tamponu + ligand + kokain (coc) hazırlayın: 25 mM HEPES, 120 mM NaCl, 5 mM KCl, 1.2 mM CaCl2, 1.2 mM MgSO4, 1 mM askorbik asit (0.194 g/L), 5 mM D-glikoz (0.991 g/L), 1 μM pargyline, 100 nM desipramin, 10 nM COMT inhibitörü, 500 μM kokain. NaOH ile pH'ı 7.4'e ayarlayın ve buz üzerinde tutun.
NOT: 7 mL alım tamponu + ligand kullanın ve kokain ekleyin. Kokain, verilerden çıkarmak için spesifik olmayan DA alımının bir arka plan ölçümünü elde etmek için eklenir ve geriye yalnızca DAT'a özgü alım kalır (çünkü SERT ve NET, yukarıda açıklandığı gibi desipramin tarafından inhibe edilir). Alternatif olarak, bunun yerine oldukça güçlü ve spesifik bir DAT inhibitörü GBR-12935 kullanılabilir.
Önemli: Bundan sonra her şeyi buz üzerinde tutun.
- Sinaptozomal preparat
- Servikal çıkık ve dekapitasyon ile her seferinde bir fareyi feda edin.
- Kafatasını ortaya çıkarmak için cildi makas kullanarak kesin ve kafatasının arka tarafındaki fazla dokuyu dekapitasyondan kalan fazla dokuyu kesin. Kafatasını sutura sagittalis boyunca küçük düz bir makasla kesin ve mümkün olduğunca öne doğru kesin.
- İki makas ucunu farenin her bir gözüne yerleştirin ve kafatasının geri kalanını ve sağlam beyni çıkarmak için kafatasını kesin. Beyni hızla çıkarın ve buz gibi soğuk PBS'ye yerleştirin. Bu, ikinci beyin disseke edilirken onu soğuk tutacaktır.
- Bir beyin matrisi kullanarak, striatumun 3 mm'lik bir koronal dilimini (ön-arka: +1,5 mm ila -1,5 mm) diseksiyon yapın, ardından bir zımba ile daha ince diseksiyon yapın. Punch alanı için Şekil 1'ye bakın.
- Dokuyu her zaman ileriye doğru hareket ettirerek buz üzerinde tutun.
- Dokuyu tartmak için 1,5 mL'lik bir mikro santrifüj tüpüne aktarın.
NOT: Bu ağırlık adım 1.2.14'te kullanılacaktır.
- İkinci beyin için 1.2.1-1.2.6 adımlarını tekrarlayın.
- Her iki beyin için ağırlık elde edildikten sonra, dokuyu 1 mL buz gibi soğuk homojenizasyon tamponu içeren bir homojenizasyon kabına aktarın.
- 800 rpm'de, 10 eşit vuruşta motor tahrikli bir havaneli kullanarak dokuyu homojenize edin.
NOT: Bir vuruş, bir yukarı ve aşağı harekete eşittir. İlk vuruş yaklaşık 5 s, sonraki 3-4 s olmalıdır. İzotonik ortamda homojenizasyon, sinaptozomların patlamasını önlemek için önemlidir. Uygun kuvvet ve izotonik ortamın kullanılması, presinaptik terminallerin sitoplazmayı, sinaptik vezikülleri, mitokondriyi ve hücre iskeletini çevreleyen yeniden kapatmasına izin verecektir.
- Homojenatı 1,5 mL'lik bir mikro santrifüj tüpüne aktarın ve kalan homojenatı 0,5 mL ilave homojenizasyon tamponu ile durulayarak homojenizasyon camından toplayın.
- Diğer beyinden gelen doku homojenize edilirken numuneyi buz üzerinde tutun. 1.2.12-1.2.13 adımlarında iki beyni paralel olarak çalıştırın.
- Çekirdekleri ve hücre kalıntılarını santrifüjleme (1.000 x g, 10 dk, 4°C) ile peletleyin.
- Süpernatanı (S1) (hücre zarları ve sitoplazma içeren) yeni 1.5 mL mikrosantrifüj tüplerine aktarın ve 4 ° C'de 20 dakika boyunca 16.000 x g'da santrifüjleyin.
- Süpernatanı (sitoplazma içeren) atın ve peleti (P2) (ham sinaptozomlar içeren) 40 μL homojenizasyon tamponu / mg dokuda (adım 1.2.6'da elde edilen ağırlığa göre) yeniden süspanse edin. Ham sinaptozomal fraksiyonu bir p1000 pipeti ile nazikçe yeniden süspanse edin, çünkü çok fazla kuvvet sinaptozomları kıracaktır.
NOT: En az 280 μL ile bitirmek önemlidir. Aksi takdirde, mg başına 40 μL'den fazla seyreltme gerekli olacaktır. 1.2.1-1.2.13 adımları mümkün olduğunca hızlı bir şekilde gerçekleştirilmeli ve her şey buz üzerinde tutulmalıdır. Ham sinaptozomlar homojenizasyon tamponunda yeniden süspanse edilir edilmez, buz üzerinde tutuldukları sürece oldukça kararlıdırlar.
2. Alım Deneyi
- Belirlenen 12 adet 1,5 mL mikrosantrifüj tüpüne 440 μL alım tamponu + ligand + kokain ve kalan 36 adet 1,5 mL mikrosantrifüj tüpüne 440 μL alım tamponu + ligand ekleyin (düzen için Tablo 1'ye bakın).
NOT: Oda sıcaklığına getirmek için deneyin başlamasından 15 dakika önce buzdan çıkarın, ancak inhibitörleri korumak için o zamana kadar buz üzerinde tutun.
- Doygunluk eğrisi hazırlayın (dopamin (2, 5, 6-[3H]-DA) (3-H dopamin) (91.1 Ci/mmol) çeşitli nihai konsantrasyonlarda (0.031, 0.0625, 0.125, 0.25, 0.5 ve 1.0 μM)).
- Altı adet 2 mL'lik mikrosantrifüj tüpünü 10, 5, 2.5, 1.25, 0.62 ve 0.31 olarak etiketleyin.
- En düşük sayıya sahip 5 mikrosantrifüj tüpüne 750 μL alım tamponu + ligand ekleyin.
- 10 etiketli tüpe 1.455.4 μL alım tamponu + ligand, 14.6 μL dopamin (1 mM), 30 μl 3-H dopamin (11 μM) ekleyin.
- 10 etiketli tüpten 750 μL'yi 5 etiketli tüpe aktarın. İyice karıştırın ve bu tüpten 750 μL'yi 2.5 tüpe aktarın. Bu seyreltmeyi kalan tüplerle tekrarlayın.
- Cam mikrofiber filtreleri 12 kuyulu bir filtre kovasına yerleştirdikten sonra 4 mL alım tamponu ile önceden durulayın.
- 440 μL tampon içeren ilk 24 1.5 mL mikro santrifüj tüpüne (düzen için Tablo 1'e bakınız) 10 μL sinaptozomal membran süspansiyonu ekleyin. Sinaptozomların tampona daldırıldığından emin olmak için dikkatlice girdap yapın ve kısa bir süre aşağı döndürün. 37 oC'de 10 dakika.
NOT: Beyinler arasında adil bir karşılaştırma yapabilmek için alım deneyi sırasındaki sürelerde kesin olmak önemlidir. Hassasiyet için bir kronometre kullanın.
- İlk iki sütuna 10 ve 5 μM konsantrasyonlarında (bölüm 2.2) 50 μL dopamin ekleyin ve çalkalayarak 37 oC'de 5 dakika bekletin. Tam olarak 5 dakika sonra, 1 mL buz gibi soğuk alım tamponu ekleyerek reaksiyonu durdurun. Aynısını 2.5 ve 1.25 μM konsantrasyonları (bölüm 2.2) ve ardından 0.62 ve 0.31 μM konsantrasyonları için de yapın.
- Numuneleri önceden durulanmış mikrofiber filtrelere ekleyin ve 5 x 4 mL buz gibi soğuk alım tamponu ile yıkayın. Filtrelere ilk 12 numune eklendiğinde, filtreleri sintilasyon tüplerine taşıyın. Bunu sonraki 12 örnekle tekrarlayın.
- Bir sonraki beyin için 2.4-2.6 adımlarını tekrarlayın.
- Sintilasyon tüplerinin 49-51'in altına bir mikrofiber filtre yerleştirerek ve üstüne 25 μL maksimum dopamin konsantrasyonu (10 μM) ekleyerek 3 maksimum sayma tüpü hazırlayın.
- 51 sintilasyon tüpünün tümünü 1 saat çeker ocakta bırakın.
- Her sintilasyon tüpüne 3 mL sintilasyon sıvısı ekleyin ve 1 saat boyunca bir çalkalayıcı üzerinde kuvvetlice çalkalayın.
- Beta sayacında [3H]-DA'yı 1 dakika boyunca sayın.
- Programı açın ve seçin: Etiket: H-3, Plaka/Filtre: 4 mL şişe, 4'e 6, Test tipi: Normal ve Sayma süresi: 1 dk.
NOT: Bu adım, daha uygunsa ertesi gün gerçekleştirilebilir. Numuneleri gece boyunca kalay folyo ile kapalı bırakın.
- Protein tayini
- Dakika başına sayımlardan (cpm) fmol / min / μg'ye ayarlamalar için sinaptozomların protein konsantrasyonlarını belirlemek ve numuneler arasındaki alımın uygun şekilde karşılaştırılması için standart bir BCA Protein Test kiti kullanın.
3. Veri Analizi
- Her grup için bir doygunluk eğrisi oluşturmak ve reaksiyonun hızını (Vmax) ve Michaelis Menten sabitini (KM) hesaplamak için alım deneyinden elde edilen verileri kullanın.
NOT: KM değeri, Vmax'ın yarısına ulaşmak için gereken substrat konsantrasyonunu yansıtır. Buna göre, Vmax, yüzeydeki DAT sayısına ve aktivitesinin posttranslasyonel modifikasyonlar ve/veya etkileşen proteinler tarafından nasıl modüle edilebileceğine ve ayrıca iyon gradyanlarındaki değişikliklere bağlı olan DAT'ın (maksimum alım kapasitesi) işlevini doğrudan yansıtır. KM değeri, taşıyıcı için substrat afinitesinin dolaylı bir ölçüsüdür ve daha da önemlisi, posttranslasyonel modifikasyonlar ve/veya etkileşen proteinler tarafından da modüle edilebilir. Bu nedenle, fonksiyonel değişiklikleri tam olarak değerlendirmek için, örneğin bir yüzey biyotinilasyon testi ile yüzey ekspresyon seviyelerini doğrudan belirlemek önemlidir.
Tablo 1: Sinaptozomal preparat için mikrosantrifüj tüpü düzeni.
| 10 | 5 | 2.5 | 1.25 | 0.62 | 0.31 |
| 10 | 5 | 2.5 | 1.25 | 0.62 | 0.31 |
| 10 | 5 | 2.5 | 1.25 | 0.62 | 0.31 |
| 10+coc | 5+coc | 2.5+coc | 1.25+coc | 0.62+coc | 0.31+coc |
