Görselleştirme için sıçan hipokampal dilimlerinde biyositin dolu internöronların etiketlenmesi

Özet

Kaynak: Economides, G., et al. Dolu Hipokampal CA2 İnternöronlarının Biyosit Geri Kazanımı ve 3D Rekonstrüksiyonları. J. Vis. Uzm. (2018)

Bu video, biyositin dolu internöronlar içeren sabit sıçan beyin dilimlerinin boyanması prosedürünü göstermektedir. Protokol, avidin-biotin kompleksi (ABC) ile inkübasyon, HRP ve kromojenik substrat ile boyama, osmiyum tetroksit ile yapıların korunması ve görüntüleme için dokunun reçineye gömülmesini içerir.

Protokol

Hayvan örneklerini içeren tüm prosedürler, uygun hayvan etik inceleme komitesi tarafından gözden geçirilmiş ve onaylanmıştır

.

1. Elektrofizyolojik Kayıtlar ve Biyosit Dolumu Sonrası Kalsiyum Bağlayıcı Protein veya İnternöronların Protein İçeriğinin Belirlenmesi ve Biyosit Görselleştirmesi

Not: Elektrofizyolojik kayıtların sonunda, biyositin dolu hücreler içeren dilimler, histolojik işlemlerden önce gece boyunca sabitlenir. Doku hasarını önlemek için prosedürün geri kalanı başka bir günde gerçekleştirilirse, fiksatif çözelti ertesi sabah tek bir 0.1 M fosfat tamponu değişikliği ile değiştirilecektir. Fiksasyon çözeltisi (% 4 paraformaldehit,% 0.2 doymuş pikrik asit çözeltisi,% 0.025 glutaraldehit çözeltisi 0.1 M fosfat tamponu (PB) içinde) en iyi sonuç için kayıt gününde taze olarak yapılmalıdır.

1. Elektrofizyolojik kaydın sonunda, kaydedilen hücre(ler)i içeren dilimi bir boya fırçası ile dikkatlice alın ve yapay beyin omurilik sıvısı (ACSF) içeren bir tencereye koyun.
   not: Keskin elektrotlar kullanılarak dilim hazırlama ve hücre içi kayıtlar için kullanılan protokolün detayları daha önce açıklanmıştır.
2. Çeker ocakta, beyin dilimini bir boya fırçasıyla dikkatlice alın ve küçük bir parça kaliteli filtre kağıdına yuvarlayın. Dilimin üzerine başka bir parça nemli filtre kağıdı yerleştirin ve iki parça ıslak filtre kağıdını 5-10 mL sabitleyici solüsyon içeren küçük bir plastik tencereye koyun ve gece boyunca buzdolabında 4 °C'de saklayın.
3. Damıtılmış suda bir jelatin çözeltisi hazırlayın. 20 mL damıtılmış suyu sıcak bir tabağın üzerine bir behere koyun ve 60 °C'ye ısıtın. Suya aşamalı olarak 2,4 g jelatin ekleyin, eriyene kadar bekleyin ve doku hasarını önlemek için kullanmadan önce 35-40 °C'ye soğumaya bırakın.
4. Fiksatif çözeltiyi 2 mL 0.1 M PB ile değiştirin. Dilimi bir Petri kabına yerleştirin ve fazla dokuyu bir neşter bıçağıyla kesin. Kesilmiş dokuyu bir Petri kabına (9 cm çapında, 1,4 cm yüksekliğinde) yerleştirin, kıvrım veya kırışıklık olmadan düz durduğundan emin olun ve kuru bir boya fırçası kullanarak fazla tamponu çıkarın.
5. Dokuyu ılık jelatin solüsyonu ile örtün ve solüsyonu hızlı bir şekilde soğutmak için Petri kabını donmuş bir blok üzerine yerleştirin.
6. Kontrast sağlamak için açılı bir lamba kullanarak, tabağın kenarından bakın ve jelatin sertleşmeye başlayana kadar ince bir boya fırçasından hafif basınç uygulayarak dilimi düz tutun.
   not: Doku düz durmazsa jelatin yeniden eritilebilir. Boya fırçasının katılaştıkça çıkarılmasından kaynaklanan jelatinin yüzeyindeki herhangi bir kusur, lambanın ampulünü birkaç saniye yüzeye yakın hareket ettirerek yüzey tabakasının nazikçe eritilmesiyle giderilebilir.
7. Jelatin ayar kabını buzdolabına alın ve 4 °C'de 30-60 dakika bekletin.
8. Bir çeker ocakta, bir neşter bıçağı kullanarak tabağın jelatine gömülü dokusunu içeren küçük bir blok (~ 1 x 1 cm) kesin, bloğu küçük bir spatula kullanarak kaldırın ve dilimleri sabitlemek için kullanılan aynı ancak taze sabitleyici solüsyona dikkatlice yerleştirin 30 ° C'de en az 30 dakika.
9. Jelatin bloğu 5 mL 0.1 M PB'de üç kez yıkayın, bir parça kağıt mendil kullanarak kurutun ve blok tarafı yukarı bakacak şekilde (yani doku üstte olacak şekilde) süper yapıştırıcı kullanarak bir vibratom aynasına yapıştırın.
10. Fazla yapıştırıcıyı bir parça filtre kağıdı ile çıkarın ve bloğun köşelerini kesmek için bir neşter bıçağı kullanın ve elmas şekli bırakın.
11. Dilimi bir vibratom kullanarak 50 μm kalınlığında bölümlere ayırın ve her bölümü dikkatlice %10 sakaroz içeren bir cam şişeye yerleştirin.
12. Şişeden dikkatlice bir bölüm alın ve düz bir şekilde bir Petri kabı kapağına yerleştirin. Bir diseksiyon mikroskobu ve yeni bir neşter bıçağı kullanarak, jelatini bölümün etrafından çıkarın ve bölümü 2 mL taze %10 sükroz
    içeren bir şişeye geri koyun not: Dehidrasyon adımı sırasında doku büzülmesini azaltmak için bu aşamada mümkün olduğunca fazla jelatinin çıkarılması çok önemlidir (Adım 1.37).
13. 0.1 M PB bazlı sükroz-gliserol çözeltisi içindeki bölümleri, oda sıcaklığında %10 sükroz çözeltisinde 10 dakika, %20 sükroz-%6 gliserol çözeltisinde iki kez 20 dakika ve son olarak 30 dakika %30 sakaroz-%12 gliserol çözeltisinde iki kez sürekli çalkalama altında kriyo-koruyun.
14. Bölümleri bir boya fırçası kullanarak küçük bir dikdörtgen kalay folyo üzerine düz bir şekilde yerleştirin. Bölümlerdeki fazla sıvıyı çıkarın ve kalay folyoyu dikkatlice bir koli içine katlayın.
15. Yüzeye 30 saniye boyunca dokunmadan paketi sıvı nitrojen yüzeyine yakın tutun ve ardından bölümlerin yaklaşık 30 saniye boyunca tamamen çözülmesine izin verin. Donma-çözülme işlemini iki kez daha tekrarlayın.
16. Tüm bölümleri bir boya fırçası ile çıkarın ve fazla sakarozdan yıkamak için sürekli çalkalama altında 2 mL 0.1 M PB içeren bir cam şişeye yerleştirin.
17. PB'yi bir Pasteur pipeti ile çıkarın ve bölümleri 2 mL% 1 sulu hidrojen peroksit (H₂O₂) içinde 30 dakika inkübe edin. Bölümleri 2 mL 0.1 M PB 3x 5 dakika yıkayın.
18. 0,1 M PB'yi bir Pasteur pipeti ile çıkarın ve 0,1 M PB.
    içinde %1 sodyum borohidrür (NaBH 4) ekleyin not: NaBH₄ çözeltisi hidrojen gazı yaydığı için şişeyi kapatmayın.
19. Sodyum borhidrürü bir Pasteur pipeti ile çıkarın ve bölümleri 2 mL 0,1 M PB 5x 5 dakika içinde iyice yıkayın.
20. 0.1 M PB'yi 30 dakika boyunca 0.1 M PB'de% 10 normal keçi serumu (NGS) ile değiştirin.
21. Keçi serumunu çıkarın ve bölümleri gece boyunca 4 ° C'de ABC çözeltisinde oluşturulan fare monoklonal ve tavşan poliklonal antikorlarının bir karışımı içinde inkübe edin.
    not: Önceki çalışmalarda kullanılan primer antikorların bir listesi Tablo 1'de gösterilmektedir.
22. Kesitleri karanlıkta 2 saat boyunca floresan etiketli ikincil antikorların bir karışımında inkübe edin (Malzeme Tablosu).
23. Bölümleri montaj ortamındaki kızakların üzerine monte edin ve üzerlerini bir lamel ile örtün.
24. 40X büyütmede floresan etiketleme resimlerini çekin (Şekil 1Bb).
25. Floresan görüntülemeden sonra, slaytı PBS içeren bir cam Petri kabına yerleştirin ve lamel dikkatlice çıkarın. Ardından, bir Pasteur pipetinden hafif PBS darbeleri kullanarak slayttaki bölümleri yıkayın. Bölümleri PBS içeren temiz bir cam şişeye yerleştirin.
26. HRP reaksiyon ürününü amplifiye etmek için öncelikle bölümleri ABC'de en az 2 saat inkübe ederek avidin-HRP reaksiyonunu gerçekleştirin.
27. 3,5 mL damıtılmış suya bir tablet ekleyerek 5 diaminobenzidin (DAB) çözeltisini hazırlayın.
28. Bölümleri PBS ile 10 dakika boyunca üç kez ve ardından 10 dakika boyunca iki kez Tris tamponu ile yıkayın. Son yıkamadan sonra Tris tamponunu çıkarın.
29. DAB çözeltisine hızlı bir şekilde bir damla %8 NiCl₂ (Nikel klorür) çözeltisi ekleyin, karıştırmak için çözeltiyi içeri ve dışarı pipetleyin ve bu çözeltiden bölümlerin üzerine hızlı bir şekilde 1 mL ekleyin. Bölümleri DAB / NiCl₂ çözeltisinde 15 dakika inkübe edin.
30. DAB çözeltisine 10 μL% 1 H₂O₂ ekleyin. Reaksiyonun karanlıkta yaklaşık 1 ila 2 dakika boyunca sürekli çalkalama altında ilerlemesine izin verin ve doldurulmuş hücrelerin etiketlenmesini bir diseksiyon mikroskobu ile izleyin.
31. DAB / NiCl₂ / H₂O₂ çözeltisini çıkararak reaksiyonu durdurun ve bölümleri Tris tamponu ile 5 dakika boyunca iki kez yıkayın.
32. Çeker ocakta, bir Petri kabına küçük bir daire filtre kağıdı yerleştirin ve 0.1 M PB ile nemlendirin. Bölümleri bir boya fırçası kullanarak cam şişeden teker teker kaldırın ve kağıdın üzerine dikkatlice düz bir şekilde yerleştirin.
33. Bölümleri başka bir nemli filtre kağıdı çemberi ile örtün ve kağıt mendili yüzeye hafifçe dokundurarak fazla tamponu çıkarın.
34. Üst kağıda 0,1 M PB'de 8-9 damla %1 osmiyum tetroksit uygulayın, tabağın üzerini örtün ve çeker ocakta en az 30 dakika, ancak en fazla 1 saat tutun.
35. Petri kabını açın ve üst filtre kağıdını kaldırın. Bölümleri bir boya fırçası ile teker teker dikkatlice kaldırın, bir cam şişeye koyun ve iki kez damıtılmış suda durulayın.
36. Osmiyum tetroksit atıklarını uygun şekilde atın. Tüm tek kullanımlık ekipmanları durulayın ve uygun kutulara koyun.
37. Her bölümü düz bir şekilde bir cam slayt üzerine yerleştirin ve bölümleri lamel ile yerleştirin. Slaytı bir Petri kabına aktarın, yerinde tutmak için lamel üzerine boş bir cam şişe yerleştirin ve üzerini %50 alkolle kapatın. 15 dakika sonra, slaytı solüsyondan çıkarın ve slayttan bölümleri çıkarın. Bölümleri tekrar slaydın üzerine yerleştirin ve ardından slaydı 15 dakika boyunca %70 alkole koyun. Aynı işlemi %95 ve son olarak %100 alkol solüsyonu ile tekrarlayın.
38. Dehidrasyon adımını takiben, bölümleri çeker ocaktaki bir çalkalayıcı üzerinde %100 alkol içeren bir cam şişeye aktarın. Alkol solüsyonunu propilen oksit (_C3H6O) iledeğiştirin ve 5 dakika boyunca üç kez yıkayın. Son yıkamanın ardından şişede ~2 mL propilen oksit bulundurun ve reçine ekleyin (1:1 oranında). Reçinenin çözündüğünden emin olun ve bölümleri 30 dakika boyunca sürekli çalkalama altında tutun.
39. Her bölümü tahta bir çubuk kullanarak epoksi reçine içeren alüminyum bir planşete yerleştirin ve gece boyunca inkübe edin.
    NOT: Bölümlere zarar verme riskini önlemek için reçine içindeki bölümleri 24 saatten daha uzun süre bırakmayın.
40. Planşeti yaklaşık 10 dakika boyunca sıcak bir tabağın üzerine yerleştirin. Her bölümü tahta bir çubukla alın ve temiz bir kaydırak üzerine yerleştirin. Bir diseksiyon mikroskobu kullanarak her bölümün yönünü tutarlı tutun. Bölümlerin üzerine bir lamel yerleştirin. Sürgüyü kürleme için 56 °C'de 48 saat fırına koyun.

Tablo 1: Çözümler tablosu.

Kullanılan çözümler	Kompozisyon/Talimatlar
Fiksasyon çözümü	0.1 M fosfat tamponunda (PB) %4 paraformaldehit, %0.2 doymuş pikrik asit çözeltisi, %0.025 glutaraldehit çözeltisi
0.1M Fosfat Tampon pH 7.6	900 mL damıtılmış suya 100 mL stok 1 M Fosfat Tamponu ekleyin
Fosfat tamponlu tuzlu su (PBS) pH 7.4/7.5	990 mL damıtılmış suya 10 mL 0.1M fosfat tamponu, 0.2 g KCl ve 8.76 g NaCl ekleyin
TRIS tampon pH 7.5	5.72 g Tris Hidroklorür ve 1.66 g Tris Bazını 50 mL damıtılmış suda çözün. Daha sonra damıtılmış su ile 1 L'ye kadar yapın.
Tamponlu glutaraldehit ve paraformaldehit fiksatif çözeltisi	0.1 M Fosfat tamponunda %4 paraformaldehit, %0.2 doymuş pikrik asit çözeltisi, %0.025 glutaraldehit çözeltisi.
ABC çözümü	ABC kitinden kullanmadan en az 30 dakika önce yapılacak çözüm. 2.5 mL PBS'ye 1 damla çözelti A ve 1 damla çözelti B ekleyin.
Durcupan epoksi reçinesi:	20 tencere yapmak için: 20 g A bileşeni, 20 g B bileşeni, 0.6 g C bileşeni ve 0.4 g D bileşeni.
	Plakayı bir daire filtre kağıdı ile kaplayarak teraziyi dökülmelere karşı koruyun. Reaktifleri yukarıda belirtilen oranlarda bir tripour behere dikkatlice tartın. İki tahta çubuk kullanarak en az 5 dakika kuvvetlice karıştırarak iyice karıştırın. Karışım homojen bir yoğunlukta koyu kahverengi renk haline gelmelidir. Mümkün olduğunca çok hava kabarcığını gidermek için beheri ~50 °C'de en fazla 10 dakika fırına koyun. not: Beheri 10 dakikadan daha uzun süre fırında bırakırsanız reçine kürlenmeye başlayacaktır. Reçineyi plastik kaplara veya 5 mL'lik şırıngalara boşaltın, tarihlendirin ve kullanıma hazır -20 °C dondurucuda saklayın.

Sonuçlar

Şekil 1: Hipokampal CA2 bölgesinde kaydedilen ve doldurulan iki tip sepet hücresinin nöronal rekonstrüksiyonları ve hücre içi kayıtları takiben elde edilen ilişkili elektrofizyolojik veriler in vitro. Bu rakam önceki çalışmalardan değiştirilmiştir. SO Stratum Oriens, SP Stratum Pyramidale, SR Stratum Radiatum, SLM Stratum Lacunosum Moleculare. (A) Aa: Kısıtl...

Malzemeler

Bu makalede kullanılan malzemelerin listesi

Ad	Şirket	Katalog numarası	Yorumlar
Avidin-7-amino-4-metilkumarin-3-asetik asit (Avidin-AMCA) antikoru- 20.8 mg/mL	Vektör laboratuvarları	A2008
Biyosit ≥%98 (TLC)	Sigma	B4261
3,5 diaminobenzidin (DAB) tablet, 5 mL	Sigma	D4293
Durcupan epoksi reçine A	Sigma	44611
Durcupan epoksi reçine B	Sigma	44612
Durcupan epoksi reçine C	Sigma	44613
Durcupan epoksi reçine D	Sigma	44614
Etanol, saf. P.A., Mutlak, ≥99.8%	Sigma	32221
Jelatin	Sigma	48723
Gluteraldehit çözeltisi, derece I, H2O	Sigma	G5882
Gliserol, ≥99%	Sigma	G5516
Keçi serumu	Sigma	G9023
Keçi anti-fare floresein izotiyosiyanat (FITC) - 14.3 mg / mL	Sigma	F2653
Keçi anti-tavşan Texas Red (TR) - 3.3 mg / mL	Invitrogen	T2767
Hidrojen peroksit, %30 çözelti	Sigma	H-1009
Daldırma yağı, viskozite 1.250 cSt (lit.)	Sigma	I0890
Nikel klorür	Sigma	N5756
Osmiyum tetroksit, elektron mikroskobu için, suda %4	Sigma	75632
Paraformaldehit, reaktif derecesi, kristal	Sigma	P6148
Su ile nemlendirilmiş pikrik asit, ≥%98	Sigma	197378
Fosfat tamponu 1 M	Sigma	P3619
Propilen oksit, %99	Alfa Aesar	30765
Sodyum tetrahidroborat	VWR	27885.134
Sükroz	Fisher bilimsel	S/8600/53
Trizma Hidroklorür, ≥99.0%	Sigma	T5941
Trizma tabanı, ≥99.9%	Sigma	T6066
Vectashield Antifade Montaj Ortamı, , kırılma indisi 1.45	Vektör laboratuvarları	H-1000
Vectastain Elite ABC HRP kiti	Vektör laboratuvarları	PK6100
Kullanılan ekipman
Vibratom	Ağar Bilimsel
C4A Çukurlu alüminyum plakalar	GA-MA & ASSOCIATES, INC.
Leica DMR mikroskobu	Leica Microsystems
X-Cite 120PC Q floresan ışık kaynağı	Excelitas Teknolojileri
Leica DFC450 dijital mikroskop kamerası	Leica Microsystems
Rapidograph teknik çizim kalemi 0.18mm	Londra grafik merkezi
0.18mm rapidograph uç	Londra grafik merkezi
Rapidograph teknik çizim kalemi 0.25mm	Londra grafik merkezi
0.25mm rapidograph uç	Londra grafik merkezi
XYZ sahne kontrolü için PC iş istasyonu, sahne, kamera ve joystic içeren Neurolucida sistemi	Microbrighfield (MBF) Biyobilim
Neurolucida yazılım sürümü 2017	Microbrighfield (MBF) Biyobilim
CorelDRAW grafik Suite X5	Corel
Video düzenleme yazılımı	Adobe Premiere Pro
Cam şişeler 14 mL	Fisher bilimsel

hazırlamak için içinde %25