C. elegans Modellerinde Motor Bozukluğun Radyal Hareket Testi Kullanılarak Değerlendirilmesi

Özet

Kaynak: Currey, H. N., et al. Amyotrofik Lateral Skleroz C. elegans Modellerinde Motor Bozukluğun Değerlendirilmesi. J. Vis. Uzm. (2021).

Bu video, vahşi tip veya ALS-mutant insan TDP-43 proteinini eksprese eden C. elegans'daki motor disfonksiyonu değerlendirmek için bir radyal hareket testinin kullanımını göstermektedir. Farklı seviyelerde vahşi tip veya mutant TDP-43 ekspresyonuna sahip solucanların sürünmesine izin verilir ve hareketleri, tahlil plakası üzerindeki merkezi noktadan kat edilen radyal mesafe ile ölçülür. Test, farklı C. elegans suşlarının kat ettiği mesafeye bağlı olarak hafif, orta ve şiddetli motor bozukluklar arasında ayrım yapar.

Protokol

1. Radyal hareket deneyi

1. 100 mm veya 150 mm çapında, yaklaşık yarısı nematod büyüme ortamı (NGM) ile dolu Petri kapları hazırlayın ve agarın tüm yüzeyini kaplayacak şekilde tek tip bir OP50 bakteri çimi ile tohumlayın.
2. NGM tahlil plakalarını ters çevirin ve alt kısmı, suş başına 2 plaka olmak üzere tahlil edilecek C. elegans suşları için bir tanımlayıcı ile etiketleyin (Şekil 1A).
3. Baş aşağı plakanın ortasındaki işaretleyici ile küçük bir nokta yapın (Şekil 1A).
4. Bir diseksiyon mikroskobu ile çalışırken, 15-20 aşamalı eşleşen solucanı, bir platin tel pena kullanarak (Şekil 1B) doğrudan merkez noktanın üzerinden tahlil plakasının merkezine aktarın.
   NOT: Tüm solucanları aynı anda veya mümkün olduğunca çabuk aktarmaya çalışın.
   1. Solucanlar plakanın ortasına yerleştirildikten sonra 30 dakika için bir zamanlayıcı ayarlayın. Kapağı tekrar tabağa koyun ve bir kenara koyun (Şekil 1C).
5. Tüm suşlar belirlenen tahlil plakalarına gelene kadar solucanları aktarmaya devam edin, plakalar arasında transferin yaklaşık olarak ne kadar sürdüğünü not edin (plakalar arasında ~ 1 dakika hedefleyin). Tüm plakaları kuruldukları sırada tutun.
6. 30 dakika sonra ilk tabağı puanlamaya başlayın.
   1. Kapağı çıkarın ve plakayı, plakanın etiketli arkası yukarı bakacak ve NGM agar görüş hattı ile solucanlar arasında olacak şekilde, diseksiyon mikroskobunun altına yüzü aşağı bakacak şekilde yerleştirin. Plaka normal kullanımdan itibaren baş aşağı olacaktır.
   2. Agardan solucanlar görünene kadar mikroskop odağını ayarlayın.
   3. Merkez noktadan farklı renkli bir keçeli kalem kullanarak, her solucanın bulunduğu yere küçük bir nokta koyun - en uzak hayvanları bulmak için bakteri çimleri boyunca solucan izlerini takip edin.
   4. Plakanın kenarını kontrol edin, çünkü bazı solucanlar orada kalabilir. Ayrıca, orta nokta noktasındaki solucanların sayısını sayın ve kaydedin (Şekil 1D).
7. Tüm tahlil plakalarını, tüm plakaların 30 dakikalık aktivite süresine sahip olacak şekilde sırayla işaretlemeye devam edin ve plakayı kurmak için geçen süreyi hesaba katmaya dikkat edin. Ardından, adım 1.8 veya 1.9'da açıklandığı gibi manuel veya dijital ölçümler gerçekleştirin.
8. Bir cetvel kullanarak manuel ölçümler yapın.
   1. Her bir solucan için merkez noktasından son konum işaretlerine olan mesafeyi mm cinsinden ölçmek için bir cetvel kullanın ve mesafeyi kaydedin. Puanlama sırasında ilerlemeyi takip etmeye yardımcı olmak için, ilk puanlanan noktayı küçük bir işaretleme çizgisiyle etiketleyin.
   2. Plakayı saat yönünde döndürerek her nokta için uzunluk verilerini art arda kaydedin (Şekil 1E).
9. Bir tarayıcı ve ImageJ kullanarak dijital ölçüm gerçekleştirin.
   1. Düz yataklı bir tarayıcı kullanarak, bir cetvelin yanındaki tahlil plakalarının arkasını tarayın (sayılar tarama yüzeyine bakacak şekilde) (Şekil 2A).
   2. Taranan plaka görüntüsünü ImageJ veya benzer bir programda açın.
      NOT: ImageJ, NIH tarafından barındırılan ücretsiz bir Java tabanlı görüntü işleme yazılımıdır.
   3. Düz Çizgi Aracına tıklayın ve ardından cetvelin taranan görüntüsündeki 1 cm ve 2 cm noktalarını birleştiren bir çizgi çizin (Şekil 2B).
      NOT: Shift bilgisayar tuşunu basılı tutmak, çizgiyi en yakın 45° açıya zorlar.
   4. Analyze menüsüne gidin ve ölçeği ayarlamak için kullanın (Analyze | Ölçeği Ayarla) (Şekil 2C).
   5. Bilinen Mesafe (10) ve Uzunluk Birimleri (mm) değerlerini uygun kutulara girin, mesafeyi piksel sayısı olarak ayarlamayın. Her ImageJ oturumunda analiz edilen tüm görüntülere aynı ölçeği uygulamak için Global seçeneğini işaretleyin; aksi takdirde, açılışta her görüntü için ölçeği ayarlayın (Şekil 2D). Tamam seçeneğine tıklayın.
      NOT: Ölçüm ölçeğini ayarlamak için 1.9.2-1.9.5 adımları gerçekleştirilir. Bu görüntü için ölçümler artık çizgilerin uzunluğunu otomatik olarak tanımlanan pikselle ilişkilendirecektir: uzunluk ilişkisi. 300 dpi'de taranan görüntüler, mm başına yaklaşık 11,8 piksellik bir ilişkiye sahip olacaktır.
   6. Boya Fırçası Aracını kullanarak atılacak ilk noktanın hemen üstünü işaretleyin.
      NOT: Bu, atılan ilk solucan için görsel bir göstergedir.
   7. Düz Çizgi Aracını kullanarak merkez noktadan ilk solucan veri noktasına bir çizgi çizin.
   8. Mesafeyi ölçmek için klavyedeki M tuşuna tıklayın. Alternatif olarak, Analyze menüsüne gidin ve Measure (Analyze | Ölçü). Her iki durumda da ölçüm yeni bir pencerede görünecektir; Bu pencere, görüntü başına tüm ölçümleri toplayacaktır.
   9. Merkez noktasını sabit tutarak, ilk solucan noktasına dokunan satırın sonunu saat yönünde hareket ederek bir sonraki solucan noktasına getirin ve ölçmek için M tuşuna tıklayın.
   10. Tüm puanlar alınana kadar her noktayı saat yönünde ölçmeye devam edin.
   11. ve uzunluk ölçüm verilerini kaydetmek için bir elektronik tabloya yapıştırın. Ardından, taranan her plaka görüntüsü için işlemi tekrarlayın.
       NOT: Adım 1.9.6 - 1.9.11, solucan yer değiştirme değerlerini ölçer (Şekil 2E-F).
10. İstatistiksel analiz yapın.
    1. Kopyaları tek bir deneyde birleştirin, böylece puanlanan toplam sayı 30-40 solucan arasında olur.
    2. 3 bağımsız deneysel kopya elde etmek için farklı günlerde ve bağımsız solucan popülasyonlarıyla bağımsız deneysel çoğaltmalar gerçekleştirin.
    3. 2 suş için Student t-testi veya üç veya daha fazla suş için 1 yönlü ANOVA gibi uygun istatistiksel analizleri kullanarak verileri analiz edin.

Sonuçlar

Şekil 1: Radyal hareket deneyi iş akışı. A-E panelleri, radyal hareket testinin genelleştirilmiş adımlarını gösterir. Adımlar aşağıdaki gibidir: (A) NGM Plakaları, kenarlara OP50 ekilmiş, merkezi nokta etiketlenerek ve işaretlenerek hazırlanır, (B) solucanlar, merkezi nokta ile işaretlendiği gibi agarın merkezine yerleştirilir, (C) ...

Malzemeler

Bu makalede kullanılan malzemelerin listesi

Ad	Şirket	Katalog numarası	Yorumlar
C. elegans	Caenorhabditis Genetik Merkezi (CGC)	-	Suşlarınızı istediğiniz gibi elde edin, N2 kullanışlı bir kontrol suşudur
Tek kullanımlık pastör pipetleri, borosilikat cam	VWR	14673-010	Solucan penası oluşturmak için kullanılan cam pipet - bir elinizde cam pipeti ve diğerinde ~ 1 "platin teli (pense tarafından tutulur) birleştirmek için bir alev üzerinde tutun.
Tek kullanımlık petri kapları, 35x10mm	VWR	10799-192	WormLab Görüntüleme Sistemi için tahlil plakaları
Tek kullanımlık petri kapları, 60x15mm	VWR	25384-090	Solucanlar için stok plakaları
Tek kullanımlık petri kapları, 100x15mm	VWR	25384-302	Standart radyal hareket test plakası
Tek kullanımlık petri kapları, 150x15mm	VWR	25384-326	Daha uzun zaman dilimi radyal hareket test plakası
Diseksiyon mikroskobu	Leica	M80	Solucanların bakımı ve radyal hareket deneylerinin ayarlanması için kapsam
İnce uçlu işaretleyiciler	VWR	52877-810	Radyal hareket deneyleri için en az 2 renge ihtiyaç vardır. Doğruluk için ince uçlar gereklidir.
Düz Yataklı Tarayıcı	Amazon	Epson Mükemmellik V850	Radyal hareket deneyi için isteğe bağlıdır. Protokol 300dpi çözünürlüğü varsayar, çoğu tarayıcı iyi çalışır
NGM (Nematod Büyüme Ortamı)	VWR	76347-412	C. elegans'ı yetiştirmek için kullanılan besiyeri. Sıfırdan yapılabilir, bakınız WormBook: C. elegans
OP50 bakterisi	Caenorhabditis Genetik Merkezi (CGC)	OP50	C. elegans için birincil besin kaynağı
P1000 pipetleyici	VWR	76207-552	Yüzme tahlilinde kullanılan pipetleyici
p1000 ipuçları	VWR	83007-384	Yüzme tahlilinde kullanılan pipetleyici uçları
Platin tel, 0,2032 mm çap	VWR	BT136585-5M	Sonsuz çekme oluşturmak için kullanılan ince ölçülü platin tel - bir elinizde cam pipeti ve diğerinde ~ 1 "platin teli (pense tarafından tutulur) birleştirmek için bir alev üzerinde tutun.
Cetvel	VWR	56510-001	Radyal hareket tahlillerini puanlamanız gerekiyor
ResimJ	NIH	-	tarafından sağlanan isteğe bağlı özgür yazılım NIH - https://imagej.nih.gov/ij/
WormLab Görüntüleme Sistemi	MBF Biyobilim	Solucan Laboratuvarı	Görüntüleme Sistemi şunları içerir WormLab donanımı (parlak alan Sahne, Kamera ve Muhafaza) ve WormLab yazılımı. https:// www.mbfbioscience.com/wormlabimaging- sistem