Hayvan örneklerini içeren tüm prosedürler, uygun hayvan etik inceleme komitesi tarafından gözden geçirilmiş ve onaylanmıştır.
1. Hazırlık
- Doku hazırlama ve kesit alma
- Sıçanları rastgele üç gruba ayırın: taze/tuzlu su (SAL;% 0.9 NaCl), önceden eklenmiş/SAL ve önek/3,4-metilendioksimetamfetamin (MDMA; tablo 1'deki ayrıntılara bakın).
- SAL ve MDMA gruplarına 2 saat aralıklarla intraperitoneal olarak sırasıyla 1 ml / kg SAL ve 10 mg / kg MDMA olmak üzere üç doz uygulayın. Hayvanların tedaviden 6 gün boyunca kurtulmasına izin verin.
- 7. günde, derin bir anestezi için sıçanlara intraperitoneal olarak 5 mg / kg ksilazin kombinasyonu içinde 100 mg / kg ketamin uygulayın (, yani , kornea göz kırpma kaybı ve kuyruk tutam refleksleri).
- Taze / SAL grubu için, farelerin başını hızla kesin ve taze beyin testi için beyni çıkarın.
- Prefix/SAL ve prefix/MDMA grupları için, sternum boyunca yaklaşık 10-12 cm'lik bir kesi yapın ve ardından sternumun ucunu ortaya çıkarın.
- Sternumun ucunu bir kanama durdurucu ile tutun ve diyaframı keskin bir makasla her iki taraftan yanal olarak kesin ve ardından kaburgalar boyunca yukarı doğru ve akciğerlere paralel olarak kesin.
- Bir elinizle, kalbin ventral ucunu küçük forsepslerle tutun. Öte yandan, sol ventrikülü 18 G'lik bir şırınga iğnesi ile delin (iğnenin adaptör tarafının Y şeklinde bir silikon hortumla buz gibi soğuk SAL ve paraformaldehit kaplarına ve peristaltik pompalara bağlandığına dikkat edin).
- SAL pompasını akış hızının orta seviyesinde (~ 5 ml / dak) açın ve dönüş sirkülasyonunun kaçmasına izin vermek için sağ atriyumu forseps ile delin. SAL perfüzyonunu 30 dakika koruyun.
- Paraformaldehit pompasını orta seviyede açın ve buz gibi %4 paraformaldehitin hayvanı 30 dakika boyunca perfüze etmesine izin verin.
- Perfüzyon aletini çıkarın ve hayvanın kafasını kesin. Kafatasının orta hattından bir posteroanterior kesi yapın ve ardından kafatası boşluğunu ortaya çıkarmak için kafatasını çırpın.
- Beyni bir spatula ile kafatası boşluğundan çıkarın ve beyni 25 ml %4 paraformaldehit içeren 50 ml'lik bir santrifüj tüpüne yerleştirin. Beyni paraformaldehit içeren tüpün içinde 4 ºC buzdolabında 24 saat tutun.
- Beyni 3 gün boyunca 4 ºC'de 25 ml% 30 sükroz çözeltisi içeren 50 ml'lik bir santrifüj tüpüne taşıyın. Son olarak, beyni kullanana kadar -80 ° C'de plastik torbalarda saklayın.
- Beyni, gömme ortamı olan bir aynaya monte edin ve beyin içeren gömme ortamını -26 ºC sıcaklıkta bir kriyostatta dondurun. Taze donmuş beyni 20 μm'lik bölümlere ve paraformaldehit önceden eklenmiş beyni 10 μm'lik bölümlere kesin. Slaytı bölüme dokundurarak bölümü oda sıcaklığında (RT) bir mikroskop lamına aktarın.
- RT'de 4 saat havayla kurutun. Kesit slaytlarını sıkıca kapalı bir torbada -80 °C'de kullanana kadar saklayın.
- Dehidratasyon
- -80 °C dondurucudan slaytlar alın ve bölümleri üç testten birine atayın: serotonin 5-HT2A reseptör geni (ht2a), ppiB (peptidilprolil izomeraz B geni, pozitif kontrol) veya dapB (bakteriyel dihidrodipikolinat redüktaz geni, negatif kontrol); Bölümleri tükenmez kalemle işaretleyin ve etiketleyin (kurşun kalem kullanmayın). Slaytları RT'de 5 dakika boyunca %100 alkole batırın. Slaytları çeker ocakta 5 dakika kurutun.
- Ön arıtma
- 20 μl Ön İşlem-1 reaktifini (alkalin fosfatazın inaktivasyonu) slaytlar üzerindeki bölümlere pipetleyin. Slaytları bir nem tepsisindeki bir raf rayına yerleştirin (reaksiyon çözeltisinden buharlaşmayı önlemek için yüksek nemi korumak için tepsinin bir kapakla kapatıldığına dikkat edin).
- Nem tepsisini yatay bir çalkalayıcı üzerinde düşük hızda 10 dakika boyunca hafifçe sallayın. Slaytları çift damıtılmış su (ddH2O) ile 2 dakika boyunca iki kez yıkayın. Slaytı, 150 ml Ön İşlem-2 reaktifi (paraformaldehit fiksasyonu ile indüklenen çapraz bağların kopması) içeren 200 ml'lik bir behere daldırın. Slaytları 5 ºC'de toplam 100 dakika kaynatın (RNA yapısının ısıya bağlı restorasyonu).
- Slaytları ddH2O ile 2 dakika boyunca iki kez yıkayın. Slaytları 5 dakika boyunca %100 alkole koyun. Slaytları çeker ocakta 5 dakika kurutun. Doku bölümünde seçilen alanın etrafına bir daire çizmek için hidrofobik bir kalem kullanın (, örneğin, , Şekil 1'da belirtildiği gibi talamus ve hipotalamus dahil olmak üzere kortikal olmayan yapılar).
- Seçilen her alana 10 μl Ön İşlem-3 reaktifi (prob penetrasyonunda artış) pipetleyin ve nem tepsisini kapakla kapatın. Tepsiyi yatay çalkalayıcı ile donatılmış hibridizasyon fırınına yerleştirin ve fırın sıcaklığını 40 ºC'ye ayarlayın; Tepsiyi 30 dakika hafifçe sallayın. Slaytları ddH2O ile 2 dakika boyunca iki kez yıkayın.
2. Hibridizasyon ve Amplifikasyon
- Seçilen alanlara sırasıyla 10 μl htr2a, ppiB ve dapB prob reaktifleri pipetleyin. Reaktifin buharlaşmasını önlemek için nem tepsisini kapakla kapatın. Düşük hızda ayarlanmış yatay çalkalayıcıyı hafifçe sallayın. Slaytları 40 ºC'deki fırında 2 saat inkübe edin.
- Slaytları 2 dakika boyunca bir yıkama tamponu ile iki kez yıkayın. Seçilen her alana 10 μl Amplifikasyon-1 reaktifi pipetleyin, slaytları çalkalayın ve 40 ºC'de 30 dakika inkübe edin.
- Slaytları 2 dakika boyunca bir yıkama tamponu ile iki kez yıkayın. Seçilen her alana 10 μl Amplifikasyon-2 reaktifi pipetleyin, slaytları çalkalayın ve 40 ºC'de 15 dakika inkübe edin.
- Slaytları 2 dakika boyunca bir yıkama tamponu ile iki kez yıkayın. Seçilen her alana 10 μl Amplifikasyon-3 reaktifi pipetleyin, slaytları sallayın ve 40 ºC'de 30 dakika inkübe edin.
- Slaytları 2 dakika boyunca bir yıkama tamponu ile iki kez yıkayın. Seçilen her alana 10 μl Amplifikasyon-4 reaktifi pipetleyin, slaytları çalkalayın ve 40 ºC'de 15 dakika inkübe edin.
- Slaytları 2 dakika boyunca bir yıkama tamponu ile iki kez yıkayın. Seçilen her alana 10 μl Amplifikasyon-5 reaktifi pipetleyin, slaytları RT'de 30 dakika boyunca sallayın ve inkübe edin.
- Slaytları 2 dakika boyunca bir yıkama tamponu ile iki kez yıkayın. Seçilen her alana 10 μl Amplifikasyon-6 reaktifi pipetleyin, slaytları RT'de 15 dakika boyunca sallayın ve inkübe edin. Slaytları 2 dakika boyunca bir yıkama tamponu ile iki kez yıkayın.
3. Sinyal Algılama
- Seçilen her alana 10 μl Kırmızı reaktif pipetleyin (Reaktifin 1:60 oranında Kırmızı-B ve Kırmızı-A karışımı olduğunu ve hemen kullanılması gerektiğini unutmayın). Sürgüyü RT'de yatay çalkalayıcı üzerindeki nem tepsisine yerleştirin ve 10 dakika boyunca düşük hızda hafifçe sallayın.
- Slaytları (ddH2O) ile 10 dakika boyunca iki kez yıkayın. Slaytları 60 ºC'deki fırında 15 dakika kurutun. Slaytları 5 dakika boyunca çeker ocak altında ksilen içine yerleştirin. Seçilen her alana 20 μl ksilen bazlı montaj ortamı pipetleyin ve bir lamel ile örtün.