Hayvan örneklerini içeren tüm prosedürler, uygun hayvan etik inceleme komitesi tarafından gözden geçirilmiş ve onaylanmıştır.
1. Beyin Dilimleme
- Numuneyi, beyinciğin sırt tarafı ön tarafta olacak şekilde yönlendirin. Beyinciğı tamamen daldırmaya yetecek kadar 1 μM TTX (Tetrodotoksin) içeren buz gibi soğuk kesme ACSF'yi (Yapay beyin omurilik sıvısı) dökün. ACSF'ye bir gaz tüpü yerleştirin ve O2/CO2 gaz karışımıyla köpürmeye başlayın.
- Dürbün altında ince bir cımbız kullanarak araknoid materyali çıkarın. Serebellar pedinkülü bir bıçakla kesin ve beyin sapını ve agar bloğunu çıkarın. Tepsiyi, beyinciğin sırt yüzeyi bir tıraş bıçağına bakacak şekilde 180° döndürün.
- Bıçağı ayarlayın ve ilk kesme konumunu ayarlayın. Vibratom dilimleme parametrelerini şu şekilde ayarlayın: genlik 5,5, frekans 85 Hz, hız 3–4 ve dilim kalınlığı 300 μm.
- Serebellar dilimi naylon bir ağ üzerinde akrilik bir inkübatöre aktarın ve dilimi tamamen oksijenli ACSF'ye daldırın. İnkübatör, sıcaklığı 26 °C olan bir su banyosuna yerleştirilmelidir.
- Dilimleme sırasında hasarın toparlanmasını sağlamak için dilimleri en az 1 saat saklayın.
2. Tüm Hücre Yama Kelepçesi Kaydı
NOT: Bir yama-kelepçe kaydı aşağıdaki ekipmanı gerektirir: kızılötesi diferansiyel girişim kontrastı (IR-DIC) optiklerine sahip dik bir mikroskop, bir yama kelepçesi amplifikatörü, veri sayısallaştırıcı, dijital stimülatör, izolatör, bilgisayar, veri toplama ve analizi için yazılım, motorlu manipülatör, mikroskop platformu, titreşim izolasyon masası, Faraday kafesi, çözelti ısıtma sistemi, peristaltik pompalar ve elektrot çekici.
- ACSF'ye pikrotoksin (0.1 mM) ekleyin ve 3 dakika boyunca ultra-sonikasyon kullanarak çözün.
- Pikrotoksin içeren, O2-CO2 ile doymuş ACSF içeren bir kayıt odasını 2 mL / dak hızında perfüze edin. Kayıt odasının sıcaklığını yaklaşık 30 °C'de tutun.
- 4 kademeli bir çektirme kullanarak filamentli (dış çap = 1,5 mm) bir borosilikat cam kılcal damarı çekerek bir kayıt elektrodu yapın. Uç çapı yaklaşık 1 μm olmalıdır.
- Çektirmeyi kullanarak aynı kılcal damarı 2 adımda çekerek uyarıcı bir elektrot yapın, ardından ucu dürbün mikroskobu altında bir demir bloğa vurarak ince bir uç elde etmek için kırın. Son çap 3–5 μm olmalıdır.
- Serebellar dilimi kayıt odasına aktarın ve naylon ipliklerle bir Pt ağırlığı ile sabitleyin. Uyarıcı bir elektrodu ACSF ile doldurun.
- PF'lerin uyarılması için, uyarıcı elektrodu moleküler katmanın yüzeyine, Purkinje hücre katmanından yaklaşık 50 μm uzağa yerleştirin.
- KF'nin uyarılması için, uyarıcı elektrodu Purkinje hücre tabakasının altına yerleştirin (adım 3.3, 3.4).
- K+ tabanlı veya Cs+ tabanlı dahili çözümü 0,45 μm filtre ile filtreleyin. Bir kayıt elektrodunu 8 μL dahili solüsyonla doldurmak için bir mikro yükleyici kullanın.
- ACSF'ye daldırmadan önce kayıt elektroduna zayıf bir pozitif basınç uygulayın. Direnci 2–4 MΩ olmalı ve sıvı bağlantı potansiyeli düzeltilmelidir.
- Kayıt elektrodu ile PC'nin sağlıklı, parlak hücre gövdesine yaklaşın. Purkinje hücresinin yüzeyini hafifçe itin, pozitif basınç uygulamayı bırakın, ardından giga-ohm'luk bir conta oluşturana kadar negatif basınç uygulayın. Ardından negatif basınç kullanarak tüm hücre konfigürasyonunu oluşturun.
- Membran potansiyelini -70 mV'de tutun ve giriş direncini, seri direnci ve giriş kapasitansını sürekli olarak izlemek için 2 Hz'de -100 mV darbe (süre, 0.1 ms) uygulayın. Seri direnç kompanzasyonunu kullanmayın. Seri direnç %15'ten fazla değiştiğinde verileri atın.
3. LTD'nin İndüksiyonu (Uzun süreli depresyon)
- Moleküler tabakayı bir nabızla uyarın (süre, 0.1 ms). Bir çift darbe uyarıcısı (50 ms'lik interspike aralığı (ISI)) uygulayarak PF (Paralel lifler) uyarıcı postsinaptik akımları (EPSC) tanımlayın. PF-EPSC, eşleştirilmiş nabız kolaylaştırması ve stimülasyon yoğunluğundaki artışa göre genlikte kademeli bir artış göstermelidir.
- 0.1 Hz'de tek bir darbe uygulayarak PF-EPSC'nin test yanıtını kaydedin. Uyaranın yoğunluğunu, uyarılan EPSC genliği yaklaşık 200 pA olacak şekilde ayarlayın. Voltaja bağlı iyonik kanaldan akımın kirlenmesini önleyin.
- Purkinje hücre tabakasının altındaki CF'yi uyarın ve CF aktivasyonu tarafından ortaya çıkan EPSC'yi tanımlayın (bir çift darbe uyarıcısı uygulayarak). CF-EPSC, stimülasyon yoğunluğundaki artışa göre eşleştirilmiş nabız depresyonu ve ya hep ya hiç şeklinde göstermelidir. LTD indüksiyonu için tek bir uyaran kullanılmalıdır.
- LTD indükleyici protokol 1
- Akım-kelepçe koşulları altında K+ bazlı iç çözelti içeren bir elektrot kullanarak, 5 dakika (300 darbe) boyunca 1 Hz'de aynı anda tek bir PF uyarıcısı ve tek bir CF uyarıcısı uygulayın (Şekil 1A).
- LTD indükleyici protokol 2
- Akım kelepçesi koşulları altında elektrot içeren K+ bazlı bir iç çözelti kullanarak, ikinci PF uyaranı 5 dakika boyunca 1 Hz'de KF uyaranlarıyla çakıştığından, çift PF uyaranı (50 ms'lik ISI) ve tek CF uyarıcısı uygulayın (Şekil 1B).
- LTD indükleyici protokol 3
- Gerilim kelepçesi koşulları altında Cs+ bazlı dahili çözelti içeren bir elektrot kullanarak, bir çift PF uyarıcısı (50 ms'lik ISI) ve tek bir depolarize edici voltaj adımı (-70 ila 0 mV, 50 ms) uygulayın 3 dakika boyunca 1 Hz'de soma'ya, böylece ikinci PF uyarıcısı depolarize edici voltaj adımının başlangıcına eşdeğer olur (Şekil 1C).
- LTD indükleyen protokol-4
- Gerilim kelepçesi koşulları altında Cs+ bazlı iç çözelti içeren bir elektrot kullanarak, PF uyaranlarını (100 Hz'de 5x) ve tek bir depolarize voltaj adımını (-70 ila 0 mV, 50 ms) 0,5 Hz'de soma'ya 3 dakika boyunca aynı anda uygulayın (Şekil 1D).
