Kan-Beyin Bariyerinin Patojen Geçişini ve Beyin Hücresi Enfeksiyonunu İncelemek için İn Vitro Bir Model

Özet

Kaynak: da Costa, A., et al. Patojenler veya İlaçlar Tarafından Bariyer Geçişlerini ve Beyinle Etkileşimlerini İncelemek için Bir İnsan Kan-Beyin Arayüzü Modeli. J. Vis. Uzm. (2019).

Bu video, kan-beyin bariyerini (BBB) geçen patojenleri incelemek için bir in vitro modeli göstermektedir. Sıkı bağlantıları ifade eden mikrovasküler endotel hücreleri, üst odacıkta bir endotel tabakası oluştururken, nöronlar, astrositler ve mikroglia, gözenekli bir zarla ayrılmış alt odacıktaki beyin parankimini temsil eder. BBB modelindeki virüs enfeksiyonu, kandan beyne geçen patojeni taklit eder. Nörotropik bir virüs ortaya çıktıktan sonra, transsitoz yoluyla BBB'yi geçer, sinir hücrelerini enfekte eder, çoğalır ve viral dölleri serbest bırakır, bu da başarılı bir nöroinvazyon gösterir.

Protokol

1. BBB-Minibrain'in (Kan-beyin bariyeri - Minibrain) yapımı ve kalite kontrolü (Şekil 1)

1. BBB-Minibrain Polyester membran kültür ekleme cihazının kurulması (Şekil 1B)
   1. İnsan beyni endotel hücre hattını (hCMEC / D3 hücreleri) deney için kullanmadan önce endotel hücre ortamında 6 gün boyunca 12 kuyulu Polyester membran kültürü ek filtrelerinde büyütün.
   2. 12 oyuklu bir plakayı poli-D-lizin (1 mL / oyuk, 10 μg / mL, RT'de 4 saat) ve ardından laminin (1 mL / oyuk, 1 μg / mL, gece boyunca RT'de) ile kaplayın.
   3. Laminini çıkarın ve% 5 fetal sığır serumu (FBS) (% 5 endotel hücre ortamı) ile desteklenmiş 1 mL endotel hücre ortamı ekleyin.
   4. 37 °C, %5_CO2 ve %95 nemde 1 saat inkübe edin.
   5. Post-mitotik insan nöronlarını (hNeuronlar) ve insan astrositlerini (hAstrositler) (NT2-N/A) ve insan mikroglial hücre hattını (CHME/Cl5) nazikçe tripsinize edin ve hücre peletlerini tam endotel hücre ortamı ile ayırın.
   6. Hücreleri sayın, 3.6 x 10⁵ NT2-N / A ve 0.4 x 10⁵ CHME / Cl5 hücreleri / kuyucuğu karıştırın ve 12 oyuklu plakayı tohumlayın.
   7. T = 24 saatte (tohumlamadan 24 saat sonra): kullanılan ortamı taze tam endotel hücre ortamı (Minibeyin hücreleri ve endotel hücreleri) ile değiştirin ve hCMEC / D3 Polyester membran kültürü ek filtresini Mini beyin hücrelerinin üstüne aktarın. BBB-Minibrain'i 37 °C, %5_CO2 ve %95 nemde inkübe edin.
      not: BBB-Minibrain daha sonra, luminal bölmeyi (veya "kan" bölmesini) izole eden filtre üzerinde bir insan endotel hücreleri hCMEC/D3 katmanından ve abluminal bölmeyi (veya "beyin" bölmesini) tanımlayan kuyunun dibinde karışık bir insan hücreleri hNT2-N/A ve hCHME/Cl5 (Minibeyin) kültüründen oluşacaktır (Şekil 1B).
2. BBB-Minibrain'in endotel geçirgenliğinin doğrulanması (Kalite Kontrol) (Şekil 1C)
   1. 10 mM 4- (2-hidroksietil) -1-piperazineetansülfonik asit (HEPES) ve 1 mM sodyum piruvat ile desteklenmiş Ca²⁺ ve Mg²⁺ ile HBSS (Hanks'in Dengeli Tuz Çözeltisi) tamponu olan taşıma tamponunu (TB) hazırlayın.
   2. Kuyucuk başına 1,5 mL taşıma tamponu ile 12 kuyulu plaka hazırlayın.
   3. T = 0'da, 50 μM Lucifer Yellow (LY-TB) ile desteklenmiş taze taşıma tamponu yapın.
   4. Endotel hücre bariyerini etkilemeden ortamı dikkatlice çıkarmak için her filtreyi ters çevirin.
   5. Filtreyi doldurulmuş 12 oyuklu plakaya yerleştirin ve 0,5 mL LY-TB ekleyin.
   6. Plakaları 37 ° C,% 5 CO₂ ve% 95 nemde bir inkübatörde inkübe edin.
   7. T = 10 dakikada, filtreleri yeni TB dolgulu 12 oyuklu plakalara aktarın ve OD okuması için ilk plakanın abluminal bölmesini tutun.
   8. T= 25 dk'da 1.2.7 adımını tekrarlayın.
   9. T= 45 dakikada, filtreleri plakalardan çıkararak taşımayı durdurun. OD ölçümleri için abluminal ve luminal bölmeleri saklayın.
   10. Numuneleri karanlık bir 96 oyuklu plakaya aktarın: LY-TB ve luminal bölmeler için 190 μL TB ile 10 μL, abluminal bölmeler için 200 μL numune.
   11. Farklı numunelerde bulunan LY-TB'nin floresansını λ428 nm λ535 nm'de (sırasıyla uyarma ve emisyon uzunluğu dalgaları) ölçün.
   12. Aşağıdaki formülü kullanarak LY-TB'ye (Pe_LY) doğru endotel geçirgenliğini (Pe) hesaplayın:
       1/PSe= (1/PSt) – (1/PSf) ve pe_LY= PSe/S.
       not: PSf, filtrenin hücresiz geçirgenliğidir, PSt, filtrenin hücrelerle geçirgenliğidir, PSe, tek tabakanın yüzeyinin endotelyal tek tabaka zamanının geçirgenliğidir, S, tek tabakanın yüzeyidir (12 oyuklu filtre için=1.12^cm2), Pe_LY cm/dk cinsinden ifade edilir. HCMEC/D3 için Pe_LY, esas olarak deneylerde kullanılan FBS'ye bağlı olarak 0,7 ile 1,2 x ^10-3 cm/dak arasında olmalıdır. Önemli bilgi: 1.2'den yüksek bir Pe_LY, BBB'nin yeterince sıkı olmadığı ve bir miktar sızıntı gözlenebileceği anlamına gelir. Bu engelleri atın.

2. Sarı Humma Virüsü aşı örneğinde nöro-invaziv viral partiküllerin varlığını vurgulamak için BBB-Minibrain'in kullanımı, Fransız Nörotropik virüsü, YFV-FNV 34 (Şekil 2)

1. Mini beyinde BBB geçişi ve Sarı humma virüslerinin çoğalması
   1. Virüsün eklenmesinden 24 saat önce adım 1.1.7'de açıklandığı gibi hazırlanan BBB-Minibrain'i kullanın; ortamı% 2 FBS endotel hücre ortamı ile değiştirin.
      not: Virüsü eklemeden hemen önce ortamı değiştirmekten kaçınmak son derece önemlidir. Ortamın değiştirilmesi, insan endotel hücrelerini aktive edebilir ve virüsün geçişine izin verecek bariyeri geçici olarak açabilir. Burada ortam, deneye başlamadan 24 saat önce değiştirilir.
   2. T = 0'da, luminal bölmenin üstüne çok dikkatli bir şekilde 50 μL% 2 FBS endotel hücre ortamında seyreltilmiş 3500 Plak Oluşturan Birim (PFU) YFV-FNV ekleyin. Kontrol BBB-Minibrain, virüssüz 50 μL% 2 FBS endotel hücre ortamı ile aşılanır. Pe_LY'yi refakatçi kuyusunda belirleyin.
   3. BBB-Minibrain'i 37 °C, %5 CO₂ ve %95 nemde bir inkübatörde inkübe edin.
   4. 24 saat sonra, polyester membran kültürü ekleri filtre cihazını çıkarın ve Pe_LY'yi belirleyin, abluminal bölmeden 1 mL numune alın ve virüsü titre edin. Ortamı taze% 2 FBS endotel hücre ortamı ile değiştirin.
   5. BBB-Minibrain'i 37 °C, %5_CO2 ve %95 nemde inkübe edin.
   6. 72 saat sonra, ortamı abluminal bölmeden örnekleyin ve virüsü titre edin ve/veya gen ekspresyon analizi için Minibrain hücrelerinden RNA'yı çıkarın.

Sonuçlar

Resim 1: BBB-Minibrain modeli. A. HCMEC / D3 kültürlerinin zaman çizelgesi ve BBB-Minibrain cihazının fotoğrafı: hCMEC / D3 endotel bariyerli bir polyester membran kültürü ekleri-filtresi, 12 oyuklu bir hücre kültürü plakasının bir kuyucuğuna yerleştirilmeden önce bir forsep ile tutulur. B. Endotel hücre bariyerini içeren luminal (Kan) bölmesi ve Minibeyin hücrelerini (insan nöronlar...

Malzemeler

Bu makalede kullanılan malzemelerin listesi

Ad	Şirket	Katalog numarası	Yorumlar
12 kuyulu plaka	Corning	3336
85mm Petri Kabı	Sarstedt	83-3902-500
CHME/Cl5	Unité de Neuroimmunologie Virale	Dr Lafon'a istek üzerine
CMC	Calbiochem	217274
Karanlık 96 kuyulu plakalar	Corning	3915
DMEM F12	Thermofisher Bilimsel	31330-038
DMSO	Merck-Sigma Aldrich	D2650
Endogro IV	Millipore	SCME004
Etanol	Carlo Erba	529121
FBS	Hyclone	SV30015-04	endotel hücre ortamı
Ca2+-Mg2+	Thermofisher Bilimsel	14025-100
hCMEC/D3	Sedir şeridi	CLU512
Hepes 1M	Thermofisher Bilimsel	15630-070
Laminine	Merck-Sigma Aldrich	L6274
L-glutamin	Thermofisher Bilimsel	25030-024
Lucifer Sarı	Merck-Sigma Aldrich	L0259
MEM 10X	Thermofisher Bilimsel	21430
MEM 1X	Thermofisher Bilimsel	42360
Ntera/Cl2D.1	ATCC	CRL-1973
Paraformaldehit	Elektron Mikroskobu Bilimleri	15714
PBS without Ca2+-Mg2+	Thermofisher Bilimsel	14190
PBS-Ca2+-MG2+	Thermofisher Bilimsel	14040-091
Kalem/Strep	Eurobio	CXXPES00-07
Poli-d-Lizin	Merck-Sigma Aldrich	P1149
Altını Uzat	Thermofisher Bilimsel	P36930
RNA saflaştırma kiti	QIAGEN	74104
Sodyum bikarbonat %5,6	Eurobio	CXXBIC00-07
Sodyum Pirüvat	Thermofisher Bilimsel	11360
T75 Hücre+ Şişe	Sarstedt	83-1813-302	Hassas yapışık hücreler için özel yüzey işlemeli (Hücre +) doku kültürü polistiren şişesi
Transwell	Corning	3460	polyester gözenekli membran kültür ekleri
Tripsin-EDTA	Merck-Sigma Aldrich	T3924
Ultra Saf Su	Thermofisher Bilimsel	10977-035
Versene	Thermofisher Bilimsel	15040-033	EDTA
YFV-FNV	IP Dakar	Aşı şişesi

ile HBSS