1. Sinekleri Çok Renkli FlpOut (MCFO) Deneyleri için Hazırlama
NOT: MCFO tekniği, Flp aracılı durdurma kaset eksizyonu (FlpOut) olarak adlandırılan şeyin değiştirilmiş bir versiyonunu ifade eder. Transgenik MCFO sinekleri, yukarı akış aktivasyon dizisi (UAS) kontrolü altında bir ısı şoku promotörü (hsp)-Flp rekombinazı ve farklı raportörler taşır. Her raportör, bir epitop etiketinin ( örneğin, ., HA, FLAG veya V5) 10 kopyasının yerleştirildiği, miristoillenmiş (myr) süper klasör yeşil floresan proteinin (sfGFP) ortak bir omurgasından oluşur. Elde edilen floresan olmayan proteinler "spagetti canavarı GFP'leri" (smGFP'ler) olarak adlandırılır ve farklı epitop etiketlerine karşı spesifik antikorlar kullanılarak tespit edilebilir.
- MCFO kaseti ve hsp-Flp (hsp-Flp; 10XUAS-FRT-stop-FRT-myr-smGFP-HA,10XUAS-FRT-stop-FRT-myr-smGFP-FLAG, 10XUAS-FRT-stop-FRT-myr-smGFP-V5) ile uygun glial GAL4 sürücü hatlarına çapraz uçar (bkz.
- Hsp zaten 25 ° C'de aktif olduğundan ve çok az hücre spesifik olmayan bir etiketlemeye yol açan rekombinasyona uğrayabileceğinden, sistemin sızıntısını önlemek için 18 ° C'de çaprazlar ayarlayın. F1 neslini elde etmek için 18 °C'de yaklaşık 20 gün bekleyin. Isı şokundan sonra (bkz. adım 2), sinekleri 25 °C'de tutun (Şekil 1).
2. Isı Şoku
NOT: Yerleştirme yerine bağlı olarak, hsp-Flp'nin verimliliği farklılık gösterebilir; Bu nedenle, optimum ısı şoku süresi optimize edilmelidir. Bu protokol için, hsp-Flp'nin X kromozomu üzerine yerleştirildiği bir MCFO sinek stoğu kullanılmıştır (bkz. Malzeme Tablosu).
- Adım 1.1'deki melez döllerini (F1 nesli sinekler, 3-4 günlük) yiyecek içeren yeni şişelere aktarın ve bir su banyosunda 37 ° C'de ısı şoku verin.
NOT: Genç sinekler (1-2 günlük) ısı şokuna karşı çok hassastır. Tedavinin neden olduğu ölüm oranını azaltmak için ısı şokunu gerçekleştirmeden önce 1 veya 2 gün daha bekleyin. F1 nesli sineklerden bazılarını ısı şoku olmadan kontrol olarak kullanın.
- Isı şoku sırasında, strese bağlı ölüm oranını azaltmak için sinekleri yiyeceklerle birlikte normal şişelerde tutun. Dişileri ve erkekleri ayrı şişelere koyun.
- Homojen bir ısı şoku sağlamak için şişenin tamamını suya batırdığınızdan emin olun. Birçok GAL4 sürücü hattına sahip glia hücrelerinin seyrek etiketlenmesi için uygun bir başlangıç noktası olarak 5-8 dakikalık bir şok kullanın; Şok süresi her sürücü ve deney için optimize edilmelidir (daha kısa veya daha uzun ısı şoku süreleri gerekli olabilir).
- Isı şokundan sonra, sineklerin ısı şokundan kurtulmasını sağlamak için şişeleri birkaç dakika tezgahın üzerine yatay olarak yerleştirin.
NOT: Şişelerin değiştirilmesine gerek yoktur.
- Sinekleri 25 °C'de tutun ve optimum raportör ifadesi için ısı şokundan 2 veya daha fazla gün sonra inceleyin (bkz. adım 3 ve 4).
3. Diseksiyon Hazırlığı ve Solüsyonları
- Diseksiyon günü, %2'lik bir PFA çözeltisi elde etmek için 180 μL S2 hücre kültürü ortamını 20 μL %20 paraformaldehit (PFA) ile karıştırarak 200 μL'lik PCR tüplerinde taze fiksatif çözelti hazırlayın. Diseksiyondan önce ve diseksiyon sırasında fiksatif solüsyonu buz üzerinde tutun.
Dikkat: PFA toksiktir ve dikkatli bir şekilde kullanılmalıdır.
NOT: %200 polimeraz zincir reaksiyonu (PCR) tüpünde 160 μL S2 hücre kültürü ortamını 40 μL %20 paraformaldehit (PFA) ile karıştırarak %2'lik bir çözelti yerine %4'lük bir PFA çözeltisi hazırlayın.
- Optimum boyama sonuçları için tüp başına maksimum 8-10 beyin ile genotip başına bir PCR tüpü kullanın.
- Yetişkin beyin yıkama solüsyonunu hazırlayın:% 0.5 sığır serum albümini,% 0.5 Triton X-100 fosfat tamponlu salin (PBS) içinde.
NOT: Lekelenmeye bağlı olarak %1 Triton X-100 içeren bir çözeltiye ihtiyaç duyulabilir. Daha yüksek bir Triton X-100 konsantrasyonu, antikorun dokuya penetrasyonunu arttırır ve dokunun derinliklerinde yatan bölgeleri boyamak gerekir (, örneğin, yetişkin Drosophila beynindeki sinaptik bölgeler).
- Bloke edici çözeltiyi hazırlayın:% 3 normal keçi serumu,% 3 normal eşek serumu ve% 0.5 Triton X-100 PBS'de.
- Yetişkin beyin yıkama solüsyonu ve bloke edici solüsyon birkaç hafta boyunca 4 ° C'de saklanabilir.
- Derin çöküntü kuyuları cam plakasını buzun üzerine koyun ve her bir kuyuyu aşağıdaki solüsyonlarla doldurun: biri %70 etanol, biri PBS ve diğeri S2 hücre kültürü ortamı ile.
4. Erişkin Beyin Diseksiyonu
- Bir stereomikroskop tablasına 3 cm'lik bir diseksiyon kabı yerleştirin ve soğuk S2 hücre kültürü ortamı ile doldurun. Diseksiyon işlemi sırasında dokunun sağlıklı kalmasını sağlamak için tüm diseksiyonları bu ortamda gerçekleştirin.
NOT: İyi bir arka plan kontrastı sağlayan (görüntülerde) birkaç milimetre siyah silikonla kaplı bir diseksiyon kabı kullanın ve diseksiyon sırasında forsepsleri koruyun.
- İstenilen genotipteki sinekleri CO2 ile uyuşturun.
- Forseps ile sineği kanatlarından tutun ve 30 saniye boyunca soğuk %70 etanol içinde yıkayın, ardından 30 saniye daha soğuk PBS ile yıkayın.
- Sineği S2 hücre kültürü ortamı ile doldurulmuş derin çöküntü kuyusuna aktarın.
- Aynı genotipteki tüm sinekler için aynı prosedürü tekrarlayın ve dokuyu koruyacak olan diseksiyona kadar soğuk S2 hücre kültürü ortamında tutun.
NOT: Yalnızca yaklaşık 30 dakikalık bir zaman diliminde incelenebilecek sinek sayısını uyuşturun. S2 hücre kültürü ortamında uzun inkübasyon süreleri dokuya zarar verebilir.
- Sineği forseps ile yakalayın ve stereomikroskop altında sineği S2 hücre kültürü ortamına batırın.
- Kafayı vücudun geri kalanından ayırın. Vücudu atın ve kafayı S2 hücre kültürü ortamına batırılmış halde tutun. Diseksiyonun tüm süresi boyunca başın forseps ile tutulması son derece önemlidir. Kafa yüzmeye başlarsa, dokuya zarar vermeden geri almak zor olacaktır.
- Diseksiyona bir gözünüzü dışarı çekerek başlayın ve başınızı her zaman en az bir forseps ile tutun. Altındaki dokuya zarar vermemek için forsepsin ucunun retinanın hemen altında olduğundan emin olun. Diğer gözü dışarı çekin ve beyin görünene kadar kütikülü çıkarmaya başlayın.
- Doku temiz görünene kadar beynin etrafındaki tüm trakeal dokuyu ve kütikülü çıkarın. Optimum boyama sonuçları için beynin etrafındaki tüm trakeal dokuyu çıkardığınızdan emin olun; Dokular artık sabitlenmeye ve boyanmaya hazırdır.
- Fiksasyon adımını zamanlamak için diseke edilen tüm beyinleri PFA çözeltisine aktarmadan önce soğuk S2 hücre kültürü ortamında tutun.
5. Yetişkin Beyin Boyama
- İzole edilmiş beyni bir P10 pipeti ile oda sıcaklığında (RT) PFA çözeltisine aktarın. Doku hasarını önlemek için, diseksiyondan sonra beyinleri aktarmak için asla forseps kullanmayın. Tüm adımları bir nutatör üzerinde 200 μL PCR tüplerinde gerçekleştirin.
- Tüm adımlar için, eski çözeltiyi bir P200 pipeti ile atmadan önce, beyinlerin tüpün dibine yerleşmesine izin verin. Dokuyu aspire etmeden süpernatanı çıkarmaya çalışın. Dokuyu ışığa maruz kalmaktan koruyun.
- Beyinleri 1 saat boyunca S2 hücre kültürü ortamında 200 μL% 2 PFA'da veya% 4 PFA'da 30 dakika boyunca sabitleyin. Tekrarlanabilirliği artırmak için numuneler arasında fiksasyon sürelerini aynı tutun.
- 200 μL yetişkin beyin yıkama solüsyonunda her biri 15 dakikalık 3 (veya daha fazla) yıkamadan sonra, dokuları 30 dakika boyunca 200 μL bloke edici solüsyon ile bloke edin. Bloke edici çözeltide daha uzun inkübasyon süreleri mümkündür.
- Beyinleri gece boyunca 4 ° C'de, toplam 200 μL hacminde yetişkin beyin yıkama solüsyonunda seyreltilmiş birincil antikorlarla kuluçkaya yatırın.
NOT: Kuluçka süreleri, kullanılan antikorun türüne bağlı olarak değişebilir. Daha uzun inkübasyonlar gerekli olabilir.
- Üç MCFO markörünün etiketlenmesi için, beyinleri anti-HA (1:500), anti-FLAG (DYKDDDDK epitopu) (1:100) ve anti-V5 birincil antikorları ile inkübe edin.
- Normal primer + sekonder kombinasyonu yerine primer doğrudan konjuge antikorlar kullanılabilir (, örn.., anti-V5:DyLight 549 (1:200)). Bu durumda, doğrudan konjuge antikorları ikincil antikorlar olarak tedavi edin.
NOT: Her genotip için, boyamanın özgüllüğünü doğrulamak için bazı beyinleri kontrol olarak tutun. Birincil antikor inkübasyonunu atlayın ve doğrudan bir sonraki adıma geçin.
- Dokuları 200 μL yetişkin beyin yıkama solüsyonunda 1 saat boyunca 3 kez yıkayın (adım 3.3) ve bunları gece boyunca 4 ° C'de veya RT'de 4 saat boyunca toplam 200 μL
hacimde yetişkin beyin yıkama solüsyonunda seyreltilmiş ikincil florofor-konjugatlar / birincil doğrudan konjuge antikorlarla inkübe edin
NOT: Uygun antikor örnekleri: AlexaFluor 488 (1:250), anti-V5:DyLight 549 (1:200) ve DyLight 647 (1:100)-konjuge antikorlar.
- Beyinleri 200 μL yetişkin beyin yıkama solüsyonunda 1 saat boyunca 3 kez yıkayın, ardından gece boyunca 4 ° C'de veya RT'de 1-2 saat boyunca 200 μL PBS'de son bir yıkama yapın; PBS'deki son yıkama adımı, Triton X-100 izlerini giderir ve optimum boyama sonuçları için gereklidir. Beyinleri, cam lameller üzerine solmaya karşı önleyici bir madde ile montaj ortamına monte edin.
6. Görüntüleme için Beyinlerin Montajı
- Makas kullanarak bir görüntüleme ara parçasını uygun boyuta kırpın. Yüksek çözünürlüklü mikroskopi için, numuneyi ve görüntüleme aralayıcısını iki cam lamel arasına sıkıştırın.
NOT: Görüntüleme ara parçaları, cam lamellere veya mikroskop lamlarına soyulup yapışan ince (0,12 mm kalınlığında) yapışkan ara parçalardır ve numunelerin sıkıştırılmadan monte edilmesini sağlar.
- Forseps kullanarak, yapışkan astarı bir yüzeyden çıkarın ve ara parçayı, yapışkan tarafı aşağı bakacak şekilde bir cam lamel yüzeyine (22 mm x 60 mm) uygulayın. Yeni bir cam lamele 10 μL montaj ortamı uygulayın.
- Bir P10 pipeti ile beyinleri 200 μL'lik tüpten lamel yerine, montaj ortamının damlasının yanına aktarın. Dokularla birlikte, beyinleri çözelti içinde tutmak için bir miktar PBS aktarın.
- Bir P10 pipeti ile beyinleri PBS'den montaj ortamının damlasına kadar hareket ettirin ve PBS miktarını sınırlamaya çalışın. Numuneleri görüntüleme ara parçası ile lamel üzerine montaj ortamında aktarın. Numuneyi kaplamak için yeterli montaj ortamı kullanın.
- Diğer yapışkan astarı ara parçanın üst tarafından çıkarın ve numunelerin üzerine bir cam lamel ekleyin. Bir forsepsin ucuyla, sızdırmaz hale getirmek için yapışkan alanın üzerine hafif bir baskı uygulayın. Takılan dokuları hemen görüntüleyin veya slaytları daha sonra analiz etmek için -20 °C'de saklayın.
