1. Gün
1. Mezenkimal Kök Hücre (MSC) Mitokondri
Etiketlenmesi
- Mitokondri hazırlığından iki gün önce, insan MSC'lerini 100 mm'lik bir kültür kabında, 10 ml (Minimum Esansiyel Orta Kartal)/FBS (Fetal sığır serumu) %10 içinde tohumlayın, böylece 1. günde kültürde 4 x 105 MSC elde edin.
- MSC'leri PBS (4 ml) ile durulayın ve 4 ml αMEM/FBS %1 ekleyin (önceden 37 °C'ye ısıtılmış).
- Gerekli miktarda mitokondri hayati boya ekleyin ve hücreleri 37 ° C inkübatörde 30 dakika inkübe edin.
- Mitokondri boya çözeltisini çıkarın, hücreleri önceden ısıtılmış 4 ml (37 °C) αMEM/FBS %1 ile iki kez durulayın ve 4 ml αMEM/FBS %10 geri ekleyin. Hücreleri 37 °C'de inkübe edin.
- Kültür ortamını (10 ml αMEM / FBS %10) 30 dakika sonra ve başka bir zaman 2 saat sonra değiştirin.
1. Gün
2. Glioblastoma Kök Hücrelerinin Etiketlenmesi (GSC)
- GSC'leri ayrıştırın Gb4 hücre hattı (10 x 106 hücre) poli-HEMA kaplı hücre kültürü şişelerinde nöroküre olarak büyütülür
- GSC proliferasyon ortamında (500 μl) 105 hücre/kuyuda 48 oyuklu bir plakada tohum GSC'leri (bkz. Tablo 1).
- Plakayı 20 °C'de 5 dakika boyunca 270 x g'da santrifüjleyin.
- Gerekli miktarda hücre hayati boyası ekleyin ve 37 °C'de 30 dakika inkübe edin.
- 48 oyuklu plakanın oyuğu başına 500 μl GSC bazal ortamı (Tablo 1) ekleyin.
- Plakayı 270 x g'da 20 °C'de 5 dakika santrifüjleyin. Süpernatanı aspire edin.
- 2.5 ila 2.6 arasındaki adımları tekrarlayın.
- 500 μl GSC bazal besiyeri ekleyin ve 37 °C'de 30 dakika inkübe edin.
- Plakayı 270 x g'da 20 °C'de 5 dakika santrifüjleyin. Süpernatanı aspire edin.
- 48 oyuklu plakanın oyuğu başına 500 μl GSC proliferasyon ortamı ekleyin ve 37 ° C inkübatörde inkübe edin.
Not: Belirtilen GSC miktarı (10 x 106 hücre), farklı doz-yanıt deneylerinin ve FACS kontrollerinin gerçekleştirilmesine izin verir. Deneysel koşullar daha kesin bir şekilde tanımlandıktan sonra, bu miktar azaltılabilir.
3. Glioblastoma Kök Hücrelerinin Tohumlanması
- GSC (Glioblastoma kök hücreleri) nörosferlerini (10 x 106 hücre) 50 ml'lik bir tüpte 20 ° C'de 5 dakika boyunca 270 x g'da santrifüjleme ile toplayın.
- Hücreleri 5 ml HBSS (Hanks'in Dengeli Tuz Çözeltisi) ile yıkayın ve 20 °C'de 5 dakika boyunca 270 x g'da santrifüjleyin.
- Süpernatanı aspire edin.
- GSC peletini 100 μl tripsin-EDTA (Etilendiamin tetraasetik asit) (% 0.25) (10 x 10 6 hücre başına)
- 37 °C'de 3 dakika inkübe edin.
- 10 μl CaCl2 (20 mM) ve 2 μl DNaz I (10 mg/ml) ekleyin.
- Bir P200 pipeti ile hafifçe yukarı ve aşağı (30-50x) pipetleyerek nörosferleri ayırın. Baloncuklardan kaçının. Mikroskop altında tüm GSC'lerin ayrıştığını kontrol edin.
- 10 μl tripsin inhibitörü (% 5) ve 10 ml HBSS ekleyin.
- GSC'leri 20 °C'de 7 dakika boyunca 270 x g'da santrifüjleyin.
- Süpernatanı atın ve 10 ml GSC bazal ortamı ekleyin.
- GSC'leri bir Thoma sayma odası ile sayın ve ardından hücreleri 20 °C'de 7 dakika boyunca 270 x g'da santrifüjleyin.
- 106 GSC/ml.
hücresel konsantrasyonuna ulaşmak için uygun hacimde GSC proliferasyon ortamı ekleyin.
- 96 oyuklu bir plakanın oyuğu başına 105 GSC (100 μl hücre süspansiyonu) tohumlayın.
- Kuyucukların dibindeki GSC'leri elde etmek için plakaları 270 x g'da 7 dakika boyunca 20 ° C'de santrifüjleyin.
- 96 oyuklu plakayı 37 °C'de inkübe edin.
2. Gün
4. MSC (Mezenkimal kök hücreler) Mitokondri İzolasyonu
- Mikrotüp santrifüj sıcaklığını 4 °C'ye ayarlayın.
- Mitokondri ekstraksiyonu için reaktifleri içeren iki adet 1.5 ml'lik tüp "A" ve "C" hazırlayın (her ikisi de EDTA içermeyen proteaz inhibitörlerini içeren 200 μl reaktif A ve 400 μl reaktif C). "MSC" ve "Mito" etiketli 2 tüp daha hazırlayın. Tüm tüpleri buz üzerinde tutun. Ayrıca mitokondri seri dilüsyonları için tüpler hazırlayın.
- MSC'leri 10 ml önceden ısıtılmış (37 °C) PBS (Fosfat tamponlu tuzlu su) ile yıkayın.
- MSC'leri 2 ml tripsin (EDTA yok) ile 10 saniye yıkayın ve 1 ml tripsin (EDTA yok) ekleyin. Hücreleri 37 °C'de 5-10 dakika inkübe edin.
- 10 ml αMEM / FBS% 10 ekleyerek MSC'leri geri kazanın, 50 ml'lik bir tüpe aktarın.
- Hücreleri 20 °C'de 5 dakika boyunca 270 x g'da santrifüjleyin.
- Süpernatanı atın ve hücre peletine 10 ml αMEM/FBS %10 ekleyin.
- MSC'leri bir Malassez sayma odası ile sayın.
- MSC'leri (4-5 x 105) 270 x g'da 20 °C'de 5 dakika santrifüjleyin.
- Süpernatanı atın, hücre peletine 1 m buz gibi soğuk αMEM/FBS %10 ekleyin ve hücreleri "MSC" etiketli tüpe aktarın. Tüpü buz üzerinde tutun.
- MSC'leri içeren tüpü 900 x g'da 5 dakika, 4 °C'de santrifüjleyin.
- Kalan tüm ortamı tüpten çıkarın.
- 200 μl Mitokondri İzolasyon Reaktifi A (EDTA içermeyen proteaz inhibitörleri içeren) ekleyin. Orta hızda 5 saniye vorteksleyin ve tüpleri tam olarak 2 dakika buz üzerinde bırakın.
- 2,5 μl Mitokondri İzolasyon Reaktifi B. Vorteks ekleyin maksimum hızda 10 saniye bekleyin ve ardından tüpleri buz üzerinde bırakın. 5 dakika boyunca her 30 saniyede bir tekrarlayın.
- 200 μl Mitokondri İzolasyon Reaktifi C (EDTA içermeyen proteaz inhibitörleri içeren) ekleyin. Tüpü eğerek karıştırın (yaklaşık 30 kez, girdap yapmayın). Tüpü 700 x g'da 4 °C'de 10 dakika santrifüjleyin.
- Süpernatanı (MSC mitokondri içeren) "Mito" tüpüne aktarın.
- Mitokondri peletini elde etmek için 3.000 x g'da, 4 °C'de 15 dakika santrifüjleyin. Süpernatanı atın. Pelet, izole edilmiş mitokondriyi içerir.
- Mitokondri peletini 200 μl Reaktif C ile durulayın. Ardından, mitokondri peletini elde etmek için 12.000 x g'da, 4 ° C'de 5 dakika santrifüjleyin.
5. İzole MSC Mitokondrilerinin GSC'lere Transferi (MitoCeption)
- MSC'lerden izole edilen mitokondri peletine (4 x 105) 200 μl önceden soğutulmuş (0 °C) GSC proliferasyon ortamı ekleyin.
- GSC'lere tutarlı bir şekilde 20 μl mitokondriyal süspansiyon eklemek için mitokondri preparatını (GSC proliferasyon ortamında) seyreltin.
- İzole edilmiş mitokondri hacmini, istenen konsantrasyonda (0.1 ila 10 μg) GSC'leri içeren 96 oyuklu plakanın kuyucuklarına ekleyin. Mitokondriyi yavaşça, kuyu dibine yakın bir yerde, tüm yüzeyi en az bir kez kaplayacak şekilde ekleyin.
- Mitokondri alıcısı GSC'leri içeren 96 oyuklu plakayı MSC mitokondri ve kontrol plakasını 1.500 x g'da 15 ° C'de 4 dakika boyunca santrifüjleyin.
- Kültür plakalarını santrifüjlemeden hemen sonra 37 °C hücre inkübatörüne yerleştirin.
Not: Mitokondri transfer protokolü, mitokondri süspansiyonunun kültürlenmiş hücreler üzerinde yeterli santrifüjleme kuvvetinde santrifüjlenmesine dayanır ve mitokondri donör/alıcı hücrelerin sistemine bağlı olarak ayarlanabilen bir dizi santrifüjleme yapılır.
Tablo 1: Kültür Medyası.
ile desteklenmiştir.
ile desteklenmiştir.
| Hücre kültürü ortamı | Kompozisyon |
| GSC bazal ortam | DMEM/F-12, |
| İnsülin 20 mg/ml |
| N2 eki 1x |
| Glikoz 3 g/L |
| L-glutamin 2 mM |
| GSC proliferasyon ortamı | Bazal ortama ekleyin: |
| B27 eki 1x |
| EGF 10 ng/ml |
| bFGF 10 ng/ml |
| Mantar 10 mg/ml |
| Mantar bölgesi 0.25 mg/ml |
| Heparin 2 mg /ml |
| Siprofloksasin 2 μg / ml |
| Gentamisin 2 μg/ml |
| MSC proliferasyon ortamı | αMEM, |
| L-glutamin 2 mM |
| %10 FBS |
| bFGF 2 ng/ml |
