Değişen sertlikteki hidrojeller üzerinde kültürlenen nöral krest hücrelerinin floresan boyanması

Özet

Kaynak: Le, T. P., et al., Nöral Krest Hücrelerinde Mekanik Sinyalleri İncelemek için Optimize Edilmiş Bir O9-1/Hidrojel Sistemi. J. V olur. Uzm. (2021)

Bu videoda, hücre iskeleti organizasyonunu görselleştirmek ve analiz etmek için değişen sertlikteki hidrojeller üzerinde kültürlenen nöral krest hücrelerinin falloidin boyamasını göstermek için floresan mikroskobu kullanarak floresan boyama gerçekleştirme prosedürünü açıklıyoruz.

Protokol

1. İmmünofloresan boyama ile sertliğin moleküler analizi

1. Doğrudan plaka üzerinde büyütülen hücrelerden gelen yanlış sinyalleri en aza indirmek için lamel yeni bir plakaya taşımak için cımbız kullanın. Ölü hücreleri ve kalan kültür ortamlarını çıkarmak için hücreleri 500 μL steril PBS ile üç kez yıkayın.
2. Hücreleri oda sıcaklığında 10 dakika boyunca rahatsız edilmemiş 500 μL %4 paraformaldehit (PFA) kullanarak sabitleyin. Ardından, hücreleri her biri 2 dakika boyunca 500 μL PBS / kuyu kullanarak üç kez yeniden yıkayın.
   NOT: Prosedürel bir durdurma için 4 °C'de saklayın.
3. Hücreleri oda sıcaklığında 15 dakika boyunca 500 μL% 0.1 Triton X-100 ile tedavi edin. Daha sonra, hücreleri 500 μL PBS / kuyu ile üç kez yıkayın.
4. Hücreleri, oda sıcaklığında 30 dakika boyunca kuyu başına 250 μL% 10 eşek serumu (PBS ve% 0.1 Tween 20'de seyreltilmiş) ile bloke edin.
5. Hücreleri, oda sıcaklığında 30 dakika boyunca 250 μL% 10 eşek serumunda 1:400 oranında bir seyreltmede F-aktin boyama için kullanılan falloidin ile inkübe edin. Ardından, hücreleri her biri 5 dakika boyunca PBS ile üç kez yıkayın.
   NOT: 568 nm Phalloidin, 488 nm veya 647 nm ikincil antikorlarla veya kendi başına birlikte inkübe edilebilir.
6. Hücreleri 4 ',6-diamidino-2-fenilindol (DAPI, 1:1000 seyreltme) ile 250 μL PBS'de 10 dakika inkübe edin ve ardından 2 dakika boyunca son bir PBS yıkaması yapın.
7. Her kuyucuğa 3-4 damla montaj ortamı ekleyin. Montaj ortamının doğru şekilde ayarlandığından emin olmak için görüntülemeden önce en az 4 saat ayarlamak için 2 °C'de saklayın.
8. Bir floresan mikroskobu ile, hidrojel numunesi başına en az 3 rastgele karenin görüntülerini yakalayarak tek tek ve birleştirilmiş kanallar oluşturun.

Malzemeler

Bu makalede kullanılan malzemelerin listesi

Ad	Şirket	Katalog numarası	Yorumlar
2 mm #1 Corning 0211 Cam Lamel	Chemglass Yaşam Bilimleri	CLS-1763-012
25 mm #1 Corning 0211 Cam Lamel	Chemglass Yaşam Bilimleri	CLS-1763-025
4 oyuklu hücre kültürü plakası	Termo Bilimsel	179830
4% Paraformaldehit	Sigma Aldrich	J61899-AP
%40 Akrilamid	Sigma Aldrich	A4058
Alexa Fluor 488 Phalloidin	Termo Balıkçı	A12379
Kollajen tip I (100mg)	Corning	354236
DAPI (4',6-Diamidino-2-fenilindol, dihidroklorür)	Termo Balıkçı	D1306
Eşek serumu	Sigma Aldrich	D9663
Steril 1x PBS	Hyclone	SH30256.02
Floresan mikroskobu	Leica