$$\rightleftharpoonup{xx}$$
$$\longleftharp{xx}$$,
$$\longrightharp{xx}$$,
Hayvan örneklerini içeren tüm prosedürler, uygun hayvan etik inceleme komitesi tarafından gözden geçirilmiş ve onaylanmıştır.
1. Çalışma çözeltilerinin ve tamponların hazırlanması
NOT: Tahlil sabahı aşağıdaki solüsyonları hazırlayın. Bu hesaplama, 12 fareden alınan iki beyin bölgesini (yani prefrontal korteks [PFC] ve hipokampus [HPC]) işlemek için gerekli çözümlere dayanmaktadır.
- Tablo 1'de belirtildiği gibi yapay beyin omurilik sıvısı (aCSF, pH = 7.4) hazırlayın. Her bir numune alma tüpüne 750 μL aCSF dağıtın ve tamponu önceden soğutmak için buz üzerindeki metal sıcaklık bloğuna yerleştirin.
- Lizis tamponunu Tablo 2'de belirtildiği gibi hazırlayın. Buz üzerinde saklayın (numune başına 400 μL kullanılacaktır).
- 5 mM sodyum sitrat tamponunda (pH = 5.0) 52 mM Bis (sülfosüksinimidil) suberat veya BS3 stok çözeltisi (26x) hazırlayın.
- İlk olarak, 100 mM sitrik asit (stok A) ve 100 mM sodyum sitrat (stok B) hazırlayın.
- Stok A ve stok B'yi deiyonize su ile 1:20 oranında seyreltin. Sırasıyla 5 mM sitrik asit (stok C) ve 5 mM sodyum sitrat (stok D) hazırlamak için 1.9 mL suya her birine 100 μL ekleyin.
- 5 mM'lik bir sodyum sitrat tamponu (pH = 5.0) (çözelti E, 1 mL) hazırlamak için 410 μL stok C ve 590 μL stok D'yi karıştırın.
- Bir pH indikatör şeridi kullanarak çözelti E'nin pH'ını onaylayın.
- BS3 stok çözeltisini (26x) hazırlamak için 30 saniye boyunca girdaplama yoluyla 806.4 μL çözelti E içinde 24 mg BS3'ü çözün.
- Çapraz bağlanmayan numuneler için araç kontrolü olarak kullanmak üzere 1 mL daha çözelti E hazırlayın.
NOT: Diğer her şey hazır olduğunda ve deney başlamak üzereyken BS3 stok çözeltisini hazırlayın. BS3, kullanılana kadar 4 °C'de kurutulmalıdır. Yeniden oluşturulduktan sonra, BS3 yalnızca yaklaşık ≤3 saat boyunca aktif kalır. 5 mM sodyum sitrat tamponunun (çözelti E) pH'ının zamanla yükseldiği ve BS3 hidrolizinin hızlanmasına neden olduğu bildirildiğinden, çözelti E'nin stok çözeltileri A ve B'den taze olarak hazırlanması önerilir. BS3'ün düşük sıcaklıklarda sınırlı çözünürlüğü nedeniyle, sulandırılmış BS3 RT'de tutulmalıdır. Sulandırılmış BS3'ü 3 saat içinde kullanın, ve sulandırılmış BS3'ü dondurmayın/çözmeyin/yeniden kullanmayın.
2. Beyin dokularının diseksiyonu
NOT: Bu adımdan itibaren en az iki kişi koordineli bir şekilde birlikte çalışmalıdır. Bir kişi hayvan diseksiyonuna odaklanırken, diğer kişi zaman tutucu olarak çalışmalı ve testi koordine etmeye yardımcı olmalıdır.
- Diseksiyon için ilk hayvanı barınma alanından diseksiyon odasına getirin.
NOT: Akut stresörler (örneğin, yeni bir ortam, kan kokusu) beyin protein dinamiklerini etkileyebileceğinden, hayvanlar diseksiyon alanından uzağa yerleştirilmiş ev kafeslerinde tutulmalı ve daha sonra derhal dekapitasyon için diseksiyon odasına ayrı ayrı getirilmelidir.
- Fareyi servikal çıkık ve ardından dekapitasyon ile ötenazi yapın. Beyni hızla kafatasından çıkarın ve 10-15 saniye boyunca bir Petri kabına buz gibi PBS'ye daldırın (Şekil 1).
NOT: Hayvanlar BS3 deneyleri için anestezi altına alınmaz, çünkü herhangi bir anestezik ajan nörotransmitter reseptörlerinin yüzey sunum seviyesini potansiyel olarak etkileyebilir.
- Soğutulmuş beyni, beynin ventral tarafı yukarı bakacak şekilde buz üzerindeki beyin matrisine yerleştirin (Şekil 2).
- Beyni koronal olarak kesmek için ilk tıraş bıçağını koku soğanı ile koku alma sapı arasındaki sınırdan geçirin (Şekil 3). Üç ila dört ek tıraş bıçağı kullanarak, beynin ön kısmını 1 mm aralıklarla koronal olarak seri olarak kesin.
- Yerleştirilen tüm tıraş bıçaklarını bir arada tutarak beyin matrisinden koronal dilimleri kaldırın ve beynin arka kısmını beyin matrisinde geride bırakın. Tıraş bıçaklarını birbirinden ayırmak için forseps kullanın ve beyin dilimi yukarı bakacak şekilde düz, soğutulmuş yüzeye yerleştirin (Şekil 4).
- İlgilenilen bölgeyi içeren dilimleri tanımlayın. PFC'yi örneklemek için, koku alma sapını içeren ilk dilimin arkasındaki ikinci ve üçüncü dilimleri seçin.
- Bir doku zımbası kullanarak ilgilenilen bölgeyi çıkarın, soğutulmuş tıraş bıçağının üzerine bir kenara koyun ve dokuyu eşit olarak ikiye bölün (örneğin, sol ve sağ hemisferden dokular, bir yarısı BS3 çapraz bağlama reaksiyonu için kullanılacak ve diğer yarısı, ilgilenilen hedef protein her iki yarım kürede eşit olarak ifade ediliyorsa, çapraz bağlanmayan kontrol için).
- Mendilleri ezmek veya öğütmek yerine, forsepsin ince ucunu kullanarak bıçağa karşı birden fazla dikey hareketle her bir dokuyu tıraş bıçağı üzerinde parçalara ayırın. Bu, hücrelerin zar bütünlüğünden ciddi şekilde ödün vermeden BS3'ün erişebileceği yüzey alanını en üst düzeye çıkaracaktır. Kıyma işleminden hemen sonra, kıyılmış dokuları uygun tüplere aktarın (bkz. adım 3.3).
3. Çapraz bağlanma reaksiyonu
- Bir önceki farenin beyninin diseksiyonu bitmek üzereyken, bir sonraki hayvanı barınma alanından diseksiyon alanından diseksiyon odasına getirin (adım 2.10).
- Kıyılmış dokular uygun tüplere aktarılmaya hazır olmadan hemen önce 30 μL BS3 solüsyonu (26x) veya araç solüsyonu E ile buz üzerinde önceden soğutulmuş tüpü açın. Çapraz bağlanmayan kontrol tüplerinde BS3 kontaminasyonu olmadığından emin olmak için tüpler arasındaki pipet uçlarını değiştirin.
- Kıyılmış dokuları (adım 2.8'den itibaren) uygun tüplere aktarın ve ardından bir sonraki hayvanı incelemeye başlayın (adım 2.2).
- Doku parçalarını daha küçük parçalara ayırmak için tüpü ters çevirin ve karıştırın ve numuneleri soğuk odada tüp döndürücü üzerinde 30 dakika ila 2 saat boyunca inkübe etmeye başlayın. Her tüp için BS3 inkübasyonunun başlangıç zamanını kaydedin. En uygun kuluçka süresi için tartışma bölümüne bakın.
- Tüpü 78 μL 1 M glisin ile dikerek reaksiyonu söndürün ve numuneyi sabit rotasyonla 4 ° C'de 10 dakika inkübe edin. Her tüp için su vermenin başlangıç ve bitiş zamanını kaydedin. Bir sonraki hayvanı getirerek (adım 3.1) ve çapraz bağlamaya yardımcı olarak (adım 3.2) hayvan diseksiyonuna odaklanan kişiye yardım etmeye devam edin.
NOT: Her numuneyi tüm numunelerde tam olarak aynı anda ele alın. Diseksiyon odası soğuk odadan uzaksa, soğuk odada numune inkübasyonuna ve su vermeye katılmak için üçüncü bir kişinin işe alınması şiddetle tavsiye edilir.
Tablo 1: Yapay beyin omurilik sıvısının bileşimi.
| Çalışma conc. | Stok çözümü | Dağıtılacak stok çözeltisi miktarı |
| 1.2 mM CaCl2 | 480 mM (400x)* | 100 μL |
| 20 mM HEPES | 1 M (50x) | 800 μL |
| 147 mM NaCl | 5 AY (34 KEZ) | 1176,5 μL |
| 2,7 mM KCl | 1,08 M (400x) | 100 μL |
| 1 mM MgCl2 | 400 mM (400x) | 100 μL |
| 10 mM Glikoz | 2,5 M (250x) | 160 μL |
| Deiyonize su | | 37.563 mL |
| toplam | | 40 mL |
| * CaCl2 stoğu deney günü taze olarak hazırlanmalıdır. |
Tablo 2: Lizis tamponunun bileşimi
| Çalışma conc. | Stok çözümü | Dağıtılacak stok çözeltisi miktarı |
| 25 mM HEPES | 1 M (40x) | 500 μL |
| 500 mM NaCl | 5 M (10 Adet) | 2 mL |
| 2 mM EDTA | 0,5 M (250x) | 80 μL |
| 1 mM DTT | 1 M (1000x) | 20 μL |
| % 0.1 NP-40 | %10 (100x) | 200 μL |
| Proteaz inhibitörü kokteyli | 100 katı | 200 μL |
| Deiyonize su | | 17 mL |
| toplam | | 20 mL |
