Yukarı Düzenlenmiş Glikoz Metabolizması ile Drosophila Larvalarının Motor Nöronlarında Glikoz Alımının Değerlendirilmesi

Bu makalede

Özet

Kaynak: Loganathan, S., et al., Drosophila TDP-43 Proteinopati Modellerinde Glikoz Alımının Ölçülmesi. J. Vis. Uzm. (2021).

Video, floresan rezonans enerji transferi (FRET) tabanlı bir hücre içi glikoz sensörü kullanarak Drosophila larva motor nöronlarında glikoz alımını ölçmek için bir tekniği göstermektedir. Ventral sinir kordonunu ortaya çıkarmak için larvaları diseksiyona tabi tuttuktan sonra, motor nöronlar, sensörün donör floroforu tarafından yayılan floresan yoluyla görselleştirilir. Glikoz ile uyarıldığında, sensörün donörü ve alıcısı floroforları arasındaki FRET, alıcıdan floresan emisyonunu tetikleyerek, kontrol larvaları ve mutant larvalar arasındaki glikoz alımının yukarı regüle edilmiş glikoz metabolizması ile karşılaştırılmasını sağlar.

Protokol

1. Drosophila Ventral Sinir Kordonu (VNC) diseksiyonları

Silikon elastomer diseksiyon tabakları yapın.
1. Silikon elastomer bileşenlerini, üreticinin protokolünde belirtildiği gibi 50 mL'lik bir tüpe dökün ve iyice karıştırın.
2. 35 mm'lik doku kültürü kaplarını yaklaşık 2 mL elastomer karışımı ile doldurun. Kabarcıkları çıkarmak için bir şırınga kullanın. Bulaşıkların üzerini örtün ve kürlenmesi için gece boyunca 60 °C fırında düz bir yüzeye koyun.
Doku canlılığını korurken VNC'yi ortaya çıkarmak için Drosophila larvalarını diseksiyon edin.
1. Dolaşan üçüncü bir instar larvası toplayın, ddH₂O ile durulayın ve ardından bir damla Hemolenf benzeri 3 (HL3) tamponuna (70 mM NaCl, 5 mM KCl, 20 mM MgCl₂, 10 mM NaHCO₃, 115 mM sükroz, 5 mM trehaloz, 5 mM hidroksietilpiperazin etan sülfonik asit [HEPES]; pH 7.1) elastomer kaplı bir tabak üzerine.
2. Diseksiyon mikroskobu altında bir çift forseps (# 5 veya 55 forseps) kullanarak, larva sırt tarafının ön ve arka uçlarını yukarı doğru sabitleyin ve larvayı böcek pimleri (Minutein Pins) ile uzunlamasına dikkatlice gerin.
3. Bir çift açılı iris makası kullanarak arka pimin hemen üzerinde bir kesi yapın. Kesiden başlayarak larvanın ön ucuna doğru dikey bir kesim yapın.
4. Gerekirse birkaç damla HL-3 tamponu ekleyin. Merkezi sinir sistemini (CNS) rahatsız etmeden trakeayı ve yüzen organların geri kalanını çıkarın. Nöromüsküler sistemi (VNC'ler, aksonlar ve nöromüsküler kavşaklar) sağlam tutarken CNS'yi ortaya çıkarmak için vücut duvarını geren flepleri sabitleyin.

2. Görüntü alımı

Görüntüleme parametrelerini optimize edin.
1. Diseksiyonlara başlamadan önce mikroskobu ve lazerleri açın. Görüntüler, 40x suya daldırma lensli dik bir konfokal mikroskop kullanılarak elde edilmelidir. Camgöbeği floresan proteinini (CFP) uyarmak için 405 nm lazer kullanın ve görüntüleri hem CFP (465-499 nm) hem de FRET (535-695 nm) algılama kanallarında elde edin.
2. Tarama hızı (6), ortalama (2), hedef (40x), yakınlaştırma (1x), iğne deliği boyutu (1 AU) ve uzamsal çözünürlük (512 x 512) gibi alım parametrelerini optimize edin. Kazancı, sinyal optimum dinamik aralıkta olacak şekilde ayarlayın. Tüm genotipler için aynı parametreler kullanılmalıdır.
VNC içindeki görüntü motor nöronları.
1. Diseke edilmiş numunenin bulunduğu silikon kabı lensin altına yerleştirin. Lensi, trehaloz-sükroz HL3 tamponu ile temas edecek şekilde indirin. Lensin tampon belleğe tamamen daldırıldığından emin olmak çok önemlidir. Gerekirse daha fazla arabellek ekleyin.
2. VNC orta hattı boyunca yer alan, odakta en az 6 motor nörondan oluşan bir optik bölümü manuel olarak seçmek için CFP ve FRET kanallarını kullanın. Motor nöronlar, glikoz sensörünün ifadesine ve ön-arka eksen boyunca pozisyona göre tanımlanır.
3. Her 10 saniyede bir 10 dakika boyunca görüntü alın. Bu görüntüler taban çizgisini temsil eder.
Glikoz takviyeli HL-3 ile uyarın.
1. Bir Pasteur pipeti kullanarak HL3 tamponu içeren trehaloz-sükrozu çıkarın ve 5 mM glikoz takviyeli HL-3 (70 mM NaCl, 5 mM KCl, 20 mM MgCl₂, 10 mM NaHCO₃, 115 mM sükroz, 5 mM glikoz, 5 mM HEPES, pH 7.1) ile değiştirin. VNC'nin hareketini mümkün olduğunca önlemek için bu adımın büyük bir özenle yapılması gerekir.
2. Her 10 saniyede bir 10 dakika daha görüntü alın. Bu görüntüler stimülasyon aşamasını temsil eder.
Görüntüleri .czi dosyaları veya görüntüleme yazılımı tarafından desteklenen herhangi bir dosya türü olarak tarih, genetik arka plan, deneysel durum (referans değer veya stimülasyon) ve kullanılan kanallar dahil olmak üzere bir dosya adıyla kaydedin.
Tüm genotipleri görüntülemek için parametreleri yeniden kullanın (Şekil 1A).

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Sonuçlar

figure-results-1
Şekil 1: TDP-43 mutantı bağlamında glikoz sensörünün görüntü analizi. (A) Başlangıç ve stimülasyon koşulları altında glikoz sensörü kontrollerinde ve TDP-43^G298S numunelerinde FRET ve CFP sinyallerinin temsili görüntüleri. Temsili bir motor nöron, her görüntüde bir ROI örneği olarak özetlenmiştir. Ölçek çubukları: 20 μm. Büyütme: 40x. (B) 20 dakikalık görü...