$$\rightleftharpoonup{xx}$$
$$\longleftharp{xx}$$,
$$\longrightharp{xx}$$,
Hayvan örneklerini içeren tüm prosedürler, uygun hayvan etik inceleme komitesi tarafından gözden geçirilmiş ve onaylanmıştır.
1. İmmün boyama
NOT: Tüm yıkama ve inkübasyonları yaklaşık 100 rpm'ye ayarlanmış bir orbital platform çalkalayıcıda gerçekleştirin. 4 °C'de gerçekleştirilen primer antikor inkübasyonu hariç tüm adımlar oda sıcaklığında gerçekleştirilir. Malzemeleri 50 mL'lik bir tüpte birleştirerek ve gece boyunca bir nutatör üzerinde karıştırarak montaj ortamını önceden hazırlayın. Işıktan koruyun ve 4 °C'de 2 aya kadar saklayın. Endojen floresan sinyali, immün boyamaya gerek kalmadan görüntüleme ve analiz için yeterliyse, 1.1-1.9 adımları atlanabilir. İmmün boyamayı atlıyorsanız, TBS'de 10 dakikalık üç yıkama yapın ve adım 1.10'a geçin.
- 50 mL'lik bir tüpe 1 mL %10 Triton-X ekleyerek ve tüpü 1x TBS ile 50 mL'ye kadar doldurarak taze bir TBST çözeltisi (TBS'de %0.2 Triton) hazırlayın. Her beyin için 2 mL bloke edici ve antikor solüsyonları (TBST'de% 10 keçi serumu) hazırlayın.
NOT: En iyi sonuçlar için, her yeni boyama deneyi için taze TBST yapın ve yüksek kaliteli %10 sulu Triton-X kaynağı kullanın ( Malzeme Tablosu).
- 24 oyuklu bir plakayı şemaya göre etiketleyin (Şekil 1). Farklı numuneleri farklı satırlara ve farklı çözeltileri farklı sütunlara yerleştirin. İlk üç sütuna 1 mL TBST ekleyin ('Yıkama 1', 'Yıkama 2' ve 'Yıkama 3'). Dördüncü sütuna 1 mL blokaj çözeltisi ekleyin.
- 5.75 Pasteur pipetinin ucunu bir Bunsen brülörü kullanarak küçük bir kanca halinde eriterek bir cam kazma hazırlayın. Doku kesitlerini 12 oyuklu plakadan 24 oyuklu plakanın Yıkama 1 sütununa aktarmak için bu seçimi kullanın.
NOT: En iyi sonuçlar için, boyamaya başlamadan önce bölümleri tarayın. Bölümleri taramak için, bölümleri tek tek 1x TBS ile doldurulmuş bir Petri kabına aktarın ve yeterli sayıda floresan etiketli hücrenin mevcut olduğundan emin olmak için bölümleri 5x veya 10x objektifli bir floresan mikroskobu kullanarak inceleyin. Oyuk başına dört ila altı bölümün boyanması önerilir, ancak gerekirse oyuk başına sekize kadar boyanabilir.
- Bölümleri 1, 2 ve 3 kuyucuklarında 10 dakika yıkayın, ardından bloke edici solüsyonda 1 saat inkübe edin. Bölümleri bir kuyudan diğerine aktarmak için cam penayı kullanın. Seçim, aynı anda birden fazla beyin bölümünü aktarmak için kullanılabilir.
- Her numune için 1 mL birincil antikor çözeltisi hazırlayın (ör., Tavşan RFP 1:2000 veya Tavuk GFP 1:2000). Antikoru antikor çözeltisine ekleyin, kısaca girdap yapın ve ardından 4 ° C'de ≥ 4.000 x g'de 5 dakika santrifüjleyin. Çalkalarken bölümleri birincil antikorda 4 ° C'de iki ila üç gece inkübe edin.
- Birincil antikor inkübasyonundan sonra, yıkama kuyucuklarından 1. gün TBST'yi aspire edin, her yıkama kuyucuğuna 1 mL yeni TBST ekleyin ve bölümleri ilk yıkama kuyusuna taşıyın. Bölümleri 3x'te her birini 10 dakika yıkayın.
NOT: Aspirasyon için, hortumla bir vakum şişesine bağlı 9 inçlik bir Pasteur pipeti kullanın. Vakum kaynağı olarak ev tipi vakum hatları veya elektrikli vakum pompası kullanılabilir.
- Bölümler yıkanırken, antikor çözeltisine antikorlar ekleyerek 1:200 konsantrasyonda ikincil antikor çözeltileri hazırlayın (ör., keçi anti-tavşan 594 veya keçi anti-tavuk 488). Kısa bir süre girdap yapın ve ardından 4 °C'de ≥ 4.000 x g'de 5 dakika döndürün.
- İkincil antikordaki bölümleri oda sıcaklığında 3 saat inkübe edin. İkincil antikorların ağartılmasını azaltmak için bu adım ve sonraki tüm adımlar sırasında bölümleri ışıktan koruyun.
- İkincil antikor inkübasyonundan sonra, 2. gün TBST'yi yıkama kuyucuklarından aspire edin, her yıkama kuyucuğuna 1 mL yeni TBST ekleyin ve bölümleri ilk yıkama kuyucuğuna taşıyın. Bölümleri TBST'de 3x olarak her biri 10 dakika yıkayın.
- Son yıkama sırasında, montaj ortamını 4 °C'den çıkarın ve oda sıcaklığına ısınmasını bekleyin. 2: 1 oranında 1x TBS: damıtılmış su karışımı hazırlayın ve bunu bir Petri kabına ekleyin. Yüzeye 800 μL 2:1 TBS:dH2O ekleyerek bir mikroskop lamı hazırlayın.
NOT: Kürlenmeyen montaj ortamının kullanılması şiddetle tavsiye edilir. Sertleştirici montaj ortamı, dokunun hacmini değiştirebilir ve bu da astrosit bölge hacminin analizini karıştırabilir. Basit ve ucuz bir ev yapımı montaj ortamı için bir tarif, Malzeme Tablosu'nda verilmiştir.
- İnce bir boya fırçası kullanarak, bölümleri teker teker Wash 3 kuyusundan Petri kabına aktarın. Bu adım tritonu kaldırır ve bölümlerin düzleşmesine yardımcı olur. Ardından, Petri kabından gelen bölümleri slayttaki sıvıya aktarın.
- Bölümleri slayt üzerinde düz olacak şekilde düzenlemeye yardımcı olması için bir boya fırçası kullanın. Slayttaki fazla sıvıyı bir P1000 pipeti ile dikkatlice çıkarın, ardından vakum aspirasyonu yapın.
NOT: Vakum aspirasyonunun daha hassas kontrolü için Pasteur pipetinin ucuna bir P200 pipet ucu ekleyin.
- Slayttaki tüm fazla sıvı çıkarıldıktan sonra, her bölüme hemen bir damla montaj ortamı eklemek için bir transfer pipeti kullanın ve slaytın üzerine nazikçe bir lamel yerleştirin. Montaj ortamının birkaç dakika yayılmasına izin verin ve ardından lamel altından çıkan fazla montaj ortamını vakum aspirasyonu ile çıkarın.
NOT: Montaj ortamını eklemeden önce bölümlerin kurumasına izin vermeyin. Montaj ortamı eklenmeden önce bölümler kurumaya başlarsa, bu doku hacmini etkileyebilir ve doğru veri toplamayı engelleyebilir.
- Lamelin dört kenarını da şeffaf oje ile kapatın. Slaytları oda sıcaklığında 30 dakika kurumaya bırakın ve ardından 4 °C'de düz bir şekilde saklayın. Görüntülemeden önce en az 2 saat bekleyin veya ertesi gün görüntü alın.
NOT: GFP (yeşil floresan proteini) ve RFP'ye (kırmızı floresan protein) karşı antikorlarla boyanmış kesitler, oje ile tamamen kapatılmış olmaları koşuluyla, görüntüleme öncesinde 2 haftaya kadar saklanabilir.
