$$\rightleftharpoonup{xx}$$
$$\longleftharp{xx}$$,
$$\longrightharp{xx}$$,
Numune toplama ile ilgili tüm prosedürler enstitünün IRB yönergelerine uygun olarak gerçekleştirilmiştir.
1. Doku Bölümleme
- Kesit almak için dokudan küçük bir parça (~ 1 cm x 1 cm) kesin. Kalan dokuyu kuru buza/-80 °C dondurucuya geri koyun.
NOT: Doku bölümünün, Purkinje hücrelerinin bulunduğu ~% 95 serebellar korteks olduğundan emin olun.
- 'Aynayı' örtmek için yaklaşık 3 mm yüksekliğinde bir OCT höyüğü yerleştirin. Küçük bir höyük olana kadar katmanları yavaş, dairesel hareketlerle üstüne inşa ederek başlayın.
- OCT kısmen donduğunda, ancak merkezde hala bir miktar sıvı olduğunda, dokuyu üzerine yerleştirin. Dokuyu OCT'ye derinlemesine itmeyin. Dokunun tamamen donana kadar üzerine oturmasına izin verin, bu da 1-2 dakika sürecektir.
- Donmuş OCT'li 'aynayı' ve dokuyu kriyostat kesme koluna yerleştirin. Dokuyu kesme bıçağıyla aynı hizada olacak şekilde ayarlayın.
- Yeni sıcaklığa uyum sağlamak için dokunun kesme kolunda 15-20 dakika oturmasına izin verin.
NOT: Dokunun kalınlığına bağlı olarak, sıcaklık adaptasyonu için zamana ihtiyaç vardır. Temiz bir şekilde kesmek için dokunun gerektiği kadar oturmasına izin verin. Doku sıcaklığına alışmaya yardımcı olmak için OT ve BT'yi ayarlayın.
- Dokuyu yavaşça bıçağa yaklaştırın. Doku bıçağa ulaştığında, düzeltme işlemine başlayın. Trim kalınlığı 30 μm olarak ayarlanmalıdır.
- Korteks katmanları görünene kadar 2-3 kez kesin.
- Yuvarlanma önleyici plakayı kriyostat bıçağının hemen üzerine yerleştirin ve hizalayın.
NOT: Kriyostattaki ışıktan bıçak ve yuvarlanma önleyici plakanın arayüzünde gümüş bir çizgi belirecektir. Bu, viraj önleyici plakanın doğrudan bıçağın kenarının üzerinde olduğunu gösterir.
- Bölümleri 14 μm'de kesmeye başlayın. Düzgün kesilmiş bölümler, rulo önleyici plakanın altında düz olacaktır.
NOT: Doku sıkışmışsa, rulo önleyici plakanın yeterince soğuk olduğundan emin olun. Gerekirse, dışarıya bir parça kuru buz koymak (sahneye değmeyen taraf) rulo önleyici plakayı hızla soğutacaktır.
- 4-6 bölüm kesin ve bunları kriyostat aşaması boyunca yatay olarak hizalayın.
- Slaytı açılandırarak, dokunun tüm parçalarını bir kerede toplayın.
NOT: Fırçaları kullanarak, mendilin uçlarını yukarı kaldırın ve onları aldıktan sonra slayt için daha kolay kullanılabilir hale getirin. Bir seferde bir bölüm almayın. Oda sıcaklığındaki havaya maruz kalmak RNA bütünlüğünü bozacaktır.
DİKKAT: Membranın kriyostat aşamasına temas etmesine izin vermeyin. Membran sahneye dokunursa, cam slayttan ayrılmaya başlayacak ve LCM'yi denerken hatalara neden olacaktır.
- Hemen Adım 6'ya geçin. Fiksasyonu geciktirmeyin.
2. Mendil Sabitleme/Lekesiz Görselleştirme
- Hemen etanol fiksasyon protokolüne geçin
- Slaytı %70 etanol içeren sürgü tutucuya 2 dakika boyunca buz üzerine yerleştirin.
- Sürgüyü %95 etanol içeren sürgü tutucuya 45 saniye boyunca buz üzerine yerleştirin.
- Slaytı %100 etanol içeren sürgü tutucuya 2 dakika boyunca — RT'de
yerleştirin
- Slaytı ksilen 1 ile sürgü tutucuya 3 kez batırın — RT'de.
- Slaytı ksilen 2 ile 5 dakika boyunca sürgü tutucuya yerleştirin — RT'de.
- Temiz bir yerde en az 30 dakika kurumaya bırakın. 60 dakikaya kadar daha uzun kuruma süreleri optimaldir.
DİKKAT: Çeker ocakta kurutmak için dik duran slaytlar kullanın. Ksilen uçucudur. Slaytları düz bir şekilde döşemek, ksilenin doku bölümünde birikmesine neden olarak dokuyu çok koyu hale getirir.
3. Saklanan slaytları kullanım için çözme
- Amaçlanan kullanımdan 80 saat önce tüpü tek bir slaytla -1 °C dondurucudan çıkarın.
- Tüpü hemen açmayın. Tüpün oda sıcaklığına gelmesine izin verin. Yoğuşma sadece tüpün dışında meydana gelecektir.
- Tüp oda sıcaklığına ulaştığında ve tüm yoğuşma gittiğinde (yaklaşık 30-40 dakika), kapağı çıkarın ve sürgüyü oda sıcaklığındaki havaya maruz bırakın.
- Slaytın 15-20 dakika oda sıcaklığına alışmasına izin verin. Ardından, kapağı çıkarılmış olarak tüpün içinde bırakın.
NOT: Slayt artık LCM için hazırdır.
4. Purkinje hücrelerinin lazer yakalama mikrodiseksiyonu:
NOT: Bu protokol bölümü, yalnızca sonraki RNA dizilimi için Purkinje hücrelerinin yakalanmasıyla ilgili ayrıntıları tartışacaktır. Bu bölüm, kullanıcının UV lazer yakalama mikroskobu ve bağlı yazılım hakkında bilgi sahibi olduğunu varsayar.
- Mikroskop aşamasını ve kapak toplama kolunu RNase dekontaminatörü ile temizleyin.
- Eldivenli ellerle, slaytı mikroskobun üzerine ve toplama koluna 500 μL opak kapağa yerleştirin.
NOT: Çalışma alanını bir RNase dekontaminatörü ile temizleyerek ve sürgüye veya opak kapağa dokunurken eldivenli ellerinizi kullanarak her zaman uygun RNA tekniğini sağlayın. Sürgü ve başlık yerleştirildikten ve lazer yakalama başladıktan sonra eldivenler çıkarılabilir.
- Düşük büyütmede, opak kapağı serebellar dokunun üzerine hizalayın ve kapağın göz merceğinde görüntülenen tüm alanı kapladığından emin olun.
NOT: Opak kapağın ortalanıp ortalanmadığını yalnızca mikroskobun merceği gösterecektir. Kapak, dokunun üzerinde ortalanıp ortalanmadığını kamerayla göstermez. Lazer yakalama kapsamı tasarımına bağlı olarak, opak kapaktan görselleştirme ya yalnızca göz merceğinde olacak ya da hem mercekte hem de kamerada görüntülenecektir.
- Serebellar katmanları 5x - 10x objektif lensi ile görselleştirin ve imleci moleküler katman ile granül hücre katmanının kesiştiği bölümün (Purkinje hücre katmanı) üzerine getirin.
- 40X'e geçin ve Purkinje hücrelerini görselleştirin.
NOT: Örnek görselleştirmeler için Şekil 1 ve Şekil 2 bölümlerine bakın.
- Purkinje hücrelerini yakalamaya başlayın.
NOT: RNA dizilimi yapmak için en az 5 ng RNA gereklidir. Yaklaşık 1600-2000 Purkinje hücresi, dizileme için yeterli RNA materyali verir. RNA mikroskopta 8 saate kadar stabil kalacaktır. Seviyelerin doğru olduğundan emin olmak için toplamadan önce UV enerjisini ve UV odağını test edin. Zamanla, doku kurumaya devam edecek ve UV enerjisinin ve UV odağının değiştirilmesi gerekebilir.
