$$\rightleftharpoonup{xx}$$
$$\longleftharp{xx}$$,
$$\longrightharp{xx}$$,
Hayvan örneklerini içeren tüm prosedürler, uygun hayvan etik inceleme komitesi tarafından gözden geçirilmiş ve onaylanmıştır.
1. Beyinleri depolamak
- Konvansiyonel bir yaklaşım kullanarak yaklaşık 30 g ağırlığındaki ötenazi yapılmış yetişkin CD1 vahşi tip farelerden beyinleri hızla çıkarın ve kuru buzla önceden soğutulmuş sıvı nitrojen veya izopentan içinde 60 saniye boyunca hızlı dondurun.
- Donmuş beyinleri -80 °C'de kullanılana kadar alüminyum folyo veya konik tüplerde saklayın.
2. Beyin matrisinin hazırlanması
- Dokuyu incelemeden yirmi dört saat önce, çözülmüş dondurucu paketlerinin bir yığınına temiz bir beyin matrisi yerleştirin. Matrisin kenarlarını iki dondurucu paketi arasına sıkıştırın, tıraş bıçağı yuvalarının alt kısmı ile jel paketlerinin üst kısmı arasında yaklaşık 0,5 cm boşluk bıraktığınızdan emin olun (Şekil 1A). Soğutmaya yardımcı olmak için uçlarına alüminyum folyo yerleştirin.
NOT: Bir beyin matrisi satın alırken, incelenecek beynin tüm hacmini kaplayacak kadar büyük bir matris satın alın.
- Beyin matrisini ve dondurucu paketlerini içeren kutuyu, üst kısmı gece boyunca aralık kalacak şekilde -20 °C'lik bir dondurucuya koyun.
3. Donmuş bir cam plaka kurma
NOT: Bu kurulumun amacı, beyin bölümlerinin inceleneceği donmuş bir yüzey hazırlamaktır.
- Buzu üstten yaklaşık 5 cm'ye kadar yalıtımlı bir kutuya yerleştirin. Daha sonra buzun üzerine 2,5 cm'lik bir kuru buz tabakası yerleştirin ve numuneyi görselleştirmeye yardımcı olması için siyah plastik örtü ile örtün (Şekil 1B, Şekil 1C).
- Plastiğin üzerine bir cam tabak yerleştirin (kutunun ağzına tam olarak oturmalıdır) ve uzak köşelerdeki plakanın üzerine kuru buz yerleştirin (Şekil 1C).
- Dondurulmuş beyin matrisini dondurucudan alın ve beyni korteks tarafı yukarı bakacak şekilde yerleştirin. 10 dakika boyunca kutudaki sıcaklığa dengelenmesini bekleyin. Bu süre zarfında kutunun kapağını açık tutun.
- Sagital sinüs ve transvers sinüs bloğun dik olukları ile aynı hizada olacak şekilde beynin matris içindeki konumunu soğuk forseps ile ayarlayın (Şekil 1D). Bu, daha kolay diseksiyon için simetrik kesitlerin sağlanmasına yardımcı olacaktır. Beyni ayarlamadan önce soğuması için buzu kısa bir süre kurutmak için forseps uçlarına dokunun.
- Beyin yerine oturduğunda, soğutulmuş bir tıraş bıçağını merkezine yakın bir yere yerleştirin ve bıçağı dokuya yaklaşık 1 mm bastırın. Beyni yerinde tutmaya yardımcı olmak için rostral ve kuyruk uçlarına soğutulmuş bıçaklar ekleyin (Şekil 2A ve Şekil 2B).
- Rostral uçtan başlayarak, bıçakları teker teker ekleyin, yuvalara yerleştirin ve dokuya yaklaşık 1 mm hafifçe bastırın (Şekil 2B). Kuyruk ucuna doğru ilerleyerek 1 mm aralıklarla bıçak eklemeye devam edin.
- Bu süre zarfında beynin kaymadığından emin olun. Bıçakları yatay ve dikey olarak hizalayın (Şekil 2B). Kesitleri 0,5 mm genişlikte kesmek için düşük profilli mikrotom bıçakları kullanılabilir. Bunları daha büyük tıraş bıçaklarının arasına yerleştirin (Şekil 2C).
- Bıçaklar yerleştirildikten sonra, parmaklarınızla, avuç içi veya başka bir düz yüzeyle grubun üstüne bastırın (Şekil 2C, Şekil 2D). Doku boyunca hareket ettirmek için bıçak grubunu yavaşça bir yandan diğer yana sallayın.
NOT: Bu işlem biraz zaman alabilir (1-2 dk) ve sabır gerektirir. Doku boyunca hareket eden bıçaklara karşı direnç olmalıdır. Kolay giriş, beynin çözüldüğü ve bloğun kuru buzla soğutulması gerektiği anlamına gelir.
- Tüm bıçaklar yuvaların dibine ulaştığında, bıçak grubunun her iki tarafını kavrayın ve matristen kurtulmak için ileri geri sallayın.
NOT: Bıçakların keskin kenarlarında kendinizi kesmekten kaçınmak için dikkatli olun.
- Grup serbest kaldığında, yığını rostral tarafı yukarı bakacak şekilde cam plakaya yerleştirin (Şekil 2E). Daha kolay ayırma için numuneleri daha fazla dondurmak için yığının yanına ve/veya üstüne kuru buz yerleştirin.
- Keskin kenarları olan yığını cam plakanın üzerine yerleştirin ve yığını başparmaklar ve parmaklar arasında kaydırarak bıçakları ayırın. Bıçaklar, bölümler takılı olarak birbirinden ayrılmalıdır.
- Cam plaka üzerindeki bölümleri rostraldan kaudal'a doğru hizalayın (Şekil 2F).
- Bıçakları parmaklar arasında esneterek veya ikinci bir soğuk tıraş bıçağıyla ayırarak dokuyu bıçaklardan ayırın (Şekil 2G, 2H, 2I).
4. Bölümleri inceleme
- Allen Mouse Brain Atlas'ı veya başka bir referansı açın ve ilgi alanlarını belirlemek için gerekli yer işaretlerini bulun. Bazı belirgin işaretler arasında anterior komissür, korpus kallozum, lateral ventriküller ve hipokampus bulunur (Şekil 3).
- Kesilecek bölümü soğutulmuş forseps ile çevirin ve toplanmak üzere olan bölgenin baştan sona tutarlı olduğundan emin olun. Hasat sırasında, doğru yatırım getirisinin elde edildiğinden emin olmak için referans atlasına sık sık danışın.
NOT: Bu işlemde genellikle bir büyüteç veya diseksiyon mikroskobu yardımcı olur. İyi aydınlatma da önemlidir. Bu amaçla düşük voltajlı LED lambalar veya soğuk bir lamba kullanılabilir.
- Temiz bir neşter veya zımba ile bölüme kesin (Şekil 4). Kesmeden önce her aleti kuruması için kısa bir süre dokunarak önceden soğutun. Bıçağı nazikçe ama sıkı bir şekilde dokuya itin, kesimi yapmak için ileri geri sallayın. Çok sert itmeyin aksi takdirde doku kırılır.
NOT: Aletler zamanla ısınır. Hafifçe ısıtılmış bıçaklar, temiz kesimler yapmaya ve kırılmayı sınırlamaya yardımcı olabilir, ancak dokunun çözülmesini önlemek için dikkatli olun. Aletleri periyodik olarak kuru buz üzerinde soğutun.
- Bir ROI hasat edildikten sonra, onu etiketli, önceden soğutulmuş 1,5 mL'lik tüplere yerleştirin. Hasat edilen dokuları ihtiyaç duyulana kadar -80 °C'de saklayın.
