Hayvan örneklerini içeren tüm prosedürler, uygun hayvan etik inceleme komitesi tarafından gözden geçirilmiş ve onaylanmıştır.
1. İntervertebral disk (IVD) kültürü ve yükleme
- İntervertebral diskleri (IVD'ler) IVD odalarına aktarın ve IVD kültür ortamı ekleyin (Dulbecco'nun Modifiye Eagle Ortamı (DMEM, fizyolojik grup için 4.5 g / L yüksek glikoz DMEM ve patolojik grup için 2 g / L düşük glikoz DMEM) +% 1 Penisilin / Streptomisin +% 2 fetal buzağı serumu +% 1 ITS (5 μg / mL insülin içerir, 6 μg/mL transferrin ve 5 ng/mL selenöz asit) + 50 μg/mL askorbat-2-fosfat + %1 esansiyel olmayan amino asit + primer hücreler için 50 μg/mL antimikrobiyal ajan) ve 37 °C, %85 nem ve %5 CO2 sıcaklıkta bir inkübatöre koyun.
- Deney gruplarına göre diskleri bir biyoreaktör sistemi içinde 4 gün boyunca kültürleyin. Patolojik grupta, dejeneratif yükleme koşullarını 2 saat / gün boyunca 0.32-0.5 MPa, 5 Hz'de koruyun. Fizyolojik kontrol grubunda, 2 saat / gün boyunca 0.02-0.2 MPa, 0.2 Hz'lik bir yükleme protokolü kullanın.
NOT: Yükleme prosedürleri sırasında IVD'leri 5 mL IVD ortamı içeren odalara yerleştirin. Hacim, biyoreaktörün yükleme odalarının boyutuna bağlıdır. Yükleme prosedürleri arasında, serbest şişme geri kazanımı için IVD'leri 7 mL IVD kültür ortamı içeren altı oyuklu plakalara yerleştirin.
- Deney süresi boyunca disk yüksekliğindeki değişiklikleri analiz etmek için, IVD diseksiyonundan sonra (taban çizgisi) ve ardından serbest şişme döneminden sonra ve deney süresi boyunca dinamik yüklemeden sonra günlük olarak disk yüksekliğini bir kumpas ile ölçün.
2. İntradiskal tümör nekroz faktör-alfa (TNF-α) enjeksiyonu
- 1. gündeki ilk dinamik yükleme döngüsünden hemen sonra, IVD'leri dikey konumda bir Petri kabına yerleştirin ve IVD'leri bir cımbız ile sabitleyin.
- Rekombinant TNF-α (IVD başına 70 μL fosfat tamponlu salin (PBS) içinde 100 ng) 30 gauge insülin iğnesi ile patolojik grubun çekirdek pulpozus dokusuna enjekte edin. 1 dakikada yaklaşık 70 μL hızında yavaşça enjekte edin.
- Enjeksiyondan sonra, şırıngayı IVD'nin yarısına kadar geri çekin ve iğneyi ve şırıngayı IVD'den tamamen çıkarmadan önce enjekte edilen çözeltinin geri sızmasını önleyen bir vakum oluşturmak için şırınga pistonunu çekin.
NOT: Yükleme ve gece boyunca kültürden sonra enjekte edilen çözeltinin dağılımını değerlendirmek için tripan mavisi boya içeren PBS enjekte ederek bir pilot deney gerçekleştirin.
