Hayvan modellerini içeren tüm prosedürler, yerel kurumsal hayvan bakım komitesi ve JoVE veteriner incelemesi tarafından gözden geçirilmiştir.
1. Doku Toplama Öncesi Hazırlık
- Santrifüjü 4 oC.
olarak ayarlayın
- Her numune için yaklaşık 1,3, 0,8 ve 0,4 mm azalan çaplara sahip üç cam Pasteur pipetinden oluşan bir seti ateşle parlatın.
- 1 ml soğuk Tampon A içeren etiketli 1.7 ml'lik tüpleri hazırlayın ve tüpleri buz üzerinde tutun.
- Diseksiyonun yapılacağı beyin dilimleme matrisi, spatula ve cam plakalar (veya ters çevrilmiş cam Petri kabı) içeren bir buz tepsisi hazırlayın. Cam plakalar üzerinde iki veya daha fazla tıraş bıçağını önceden soğutun ve dokuya temas eden tüm aletleri kurutmak için kağıt mendil kullanın.
- Enzim çözeltisini doku toplamadan önce 30 dakika oda sıcaklığında (RT) çözdürün.
2. Doku Toplama ve Diseksiyon
- Doku toplamadan 90 dakika önce davranışsal veya farmakolojik tedaviyi başlatın.
NOT: Burada gösterilen sonuçlar için, yeni bir ortamda (test koşulu) sıçanlara ve ev kafeslerinde tutulan saf sıçanlara (kontrol koşulu) 5 mg / kg metamfetamin akut intraperitoneal enjeksiyonları yapıldı.
- Sıçanı doymuş izofluran içeren bir cam kurutucu kavanoza koyarak uyuşturun ve 30-60 saniye sonra bir giyotin kullanarak sıçanın başını alın.
Kafadaki deriyi ve kası çıkarmak ve kafatasını ortaya çıkarmak için makas kullanın. Kafatasını kesmek, foramen magnumunu açmak ve kafatasının arka kısmını çıkarmak için rongeurs kullanın. Beyni ortaya çıkarmak için kafatasının üst kenarlarını kesmek için rongeurs kullanın. Beyne zarar vermemeye dikkat edin. Beyni nazikçe altına almak ve yükseltmek için küçük bir spatula kullanın. Beyni kaldırın ve beyin serbest kalana kadar sinirleri kesin.
- Jiletli bıçak kullanarak dokuyu inceleyin.
NOT: Aşağıdaki yöntemlerden birini kullanarak doku örnekleri alın: (2.3.1) taze disseke edilmiş doku; (2.3.2) diseksiyon sonrası donmuş doku; veya (2.3.3) donmuş tüm beyinden diseke edilen donmuş doku. Beyin dilimleme matrisini, tıraş bıçaklarını ve cam plakayı diseksiyon ve kıyma işlemleri boyunca kuru tutun, çünkü yoğunlaştırılmış su hücrelerin hipotonik parçalanmasına neden olabilir. Doğru diseksiyonu sağlamak için büyüteç kullanın.
- Yeni kesilmiş doku için, yeni çıkarılmış beyni, buz üzerinde soğutulmuş bir beyin dilimleme matrisine (1 mm aralıklarla tıraş bıçağı için yuvaları olan sıçan beyni şeklinde bir metal kalıp) yerleştirin. İlgilenilen beyin bölge(ler)ini içeren koronal dilimleri kesmek için yuvalara iki veya daha fazla önceden soğutulmuş tıraş bıçağı yerleştirin. Kesilen dilimi soğutulmuş cam tabağa yerleştirin.
Not: Beynin ilgilenilen bölgelerini soğutulmuş bir cam plaka üzerinde inceleyin.
- Diseksiyondan sonra donmuş doku için, yukarıda 2.3.1'de tarif edilene benzer şekilde, yeni çıkarılmış beyin dilimlerinden ilgilenilen beyin bölgelerini inceleyin. Diseke edilen dokuyu bir mikrotüpe yerleştirin ve mikrotüpü 20 saniye boyunca -40 ºC izopentan içine batırarak dokuyu hızla dondurun. Disseke edilmiş dokuyu daha sonraki işlemlere kadar her zaman -80 ºC'lik bir dondurucuda donmuş halde tutun.
- Donmuş doku için, taze çıkarılmış beyni hemen -40 ºC izopentanın içinde dondurun ve -80 ºC'de kapalı bir torbada 6 aya kadar saklayın.
- Diseksiyon gününde, donmuş beyni, sıcaklığı dengelemek için yaklaşık 2 saat boyunca yaklaşık -20 ºC'ye (-18 ºC'den daha sıcak olmayan) ayarlanmış bir kriyostata yerleştirin.
NOT: Beyinler bu sıcaklıkta kolayca kesilebilirken, çok daha düşük sıcaklıklar beyni güvenli bir şekilde kesilemeyecek kadar kırılgan hale getirir.
- Bir kriyostatta donmuş beyinlerin 1 - 2 mm'lik koronal dilimlerini kesmek için tıraş bıçağı kullanın. Donma koşulları altında, bu dilimlerden doku zımbaları elde etmek için körelmiş 12 ila 16 gauge bir iğne kullanın. Disseke edilmiş dokuyu daha sonraki işlemlere kadar her zaman donmuş halde tutun.
- Kıymadan önce diseke edilen dokuyu kaplamak için 1-2 damla Tampon A ekleyin. Öğütme işleminin geri kalanında nöron kaybını önlemek için iki tıraş bıçağı kullanarak beyaz maddenin çoğunu dokudan çıkarın. Donmuş doku ile başlıyorsanız, Tampon A çözeltisini uygulamadan önce dokunun soğuk cam plaka üzerinde en fazla 1 dakika çözülmesine izin verin.
- Soğutulmuş bir cam plaka üzerinde bir tıraş bıçağıyla dokuyu her ortogonal yönde 100 kez kıyın. Kıyma işlemi sırasında tıraş bıçağını cam plakaya dikey olarak tutun.
NOT: Kapsamlı kıyma, tüm protokol adımları için kritik öneme sahiptir.
- Kıyılmış dokuyu 1 ml soğuk Tampon A içeren mikrosantrifüj tüplerine aktarmak için tıraş bıçağı kullanın. Tüm kıyılmış dokuyu solüsyonda tutmak için tüpü 3-5 kez ters çevirin.
3. Hücre Ayrışması
NOT: Aşağıdaki adımların tümü için yumuşak uçtan uca karıştırma kullanın. Vorteks karıştırıcı kullanmayın ve hücre hasarına neden olan hava kabarcıklarından kaçının.
- Numune tüplerini 110 ºC'de 2 dakika boyunca 4 x g'da santrifüjleyin. Süpernatanı atın. Mikrotüpün iç duvarından aşağı 1 ml soğuk, taze çözülmüş Enzim solüsyonu (proteolitik enzimlerin bir karışımını içeren) yavaşça ekleyin. Tüm peleti hemen emdirin ve kıyılmış doku peletini dağıtmak için orta derecede büyük uç çaplı bir pipetle sadece 4 kez yukarı ve aşağı nazikçe pipetleyin.
- Peletin dibe yapışmasını önlemek için mikrotüpleri hemen ters çevirin ve numuneleri uçtan uca karıştırma ile 4 oC'de 30 dakika inkübe edin.
- Enzimatik doku sindiriminden sonra, tüpleri 960 x g'da 4 ºC'de 2 dakika santrifüjleyin. Süpernatanı çıkarın ve 0.6 ml soğuk Tampon A ekleyin. Tampon A'yı ekledikten hemen sonra, tüm peleti emerek peleti dağıtmak için aynı pipet ucunu kullanın ve 5 kez hafifçe yukarı ve aşağı pipetleyin.
- Sindirilmiş dokuyu mekanik olarak ezin ve aşağıdaki adımları kullanarak 15 ml'lik tüplerde toplayın. Her numune için, lateks ampullere takılı, azalan çapları yaklaşık 1,3, 0,8 ve 0,4 mm olan 3 adet ateşle parlatılmış cam Pasteur pipetinden oluşan ayrı bir set kullanın.
- 1,3 mm cam pipetle her bir numuneyi 10 kez nazikçe ezin. Numunenin buz üzerinde 2 dakika oturmasına izin verin (kalıntılar ve ayrışmamış hücreler dibe çökecektir). Süpernatanı (~ 0.6 ml) toplayın ve 15 ml'lik bir konik tüpe (tüp # 1) aktarın.
- Kalan pelete 0.6 ml Tampon A çözeltisi ekleyin. Numuneyi 0,8 mm cam pipetle 10 kez tritüre edin. Numunenin buz üzerinde 2 dakika oturmasına izin verin. Süpernatanı (~ 0.6 ml) toplayın ve aynı 15 ml'lik konik tüp #1'e aktarın.
- Kalan pelete 0.6 ml Tampon A çözeltisi ekleyin. Numuneyi 0,4 mm cam pipetle 10 kez tritüre edin. Numunenin buz üzerinde 2 dakika oturmasına izin verin. Süpernatanı toplayın (~ 0.6 ml; ayrışmamış hücrelerle pelete dokunmadan) ve aynı 15 ml'lik konik tüp #1'e aktarın.
NOT: Aşağıdaki öğütme adımları için 0,4 mm çapındaki pipeti tüp #1'de tutun.
- En küçük cam pipeti (~ 0,4 mm çap) kullanarak adım 3.4.3'ü üç kez daha tekrarlayın ve süpernatanı ayrı bir 15 ml'lik konik tüpe (tüp #2) toplayın.
- Toplanan hücre süspansiyonlarını 0,4 mm'lik cam pipet kullanarak #1 ve #2 numaralı tüplerde 10 kez daha ezin ve buz üzerinde tutun.
4. Hücre Fiksasyonu ve Geçirgenliği
- Her tüpe 800 μl %100 soğuk etanol (kullanmadan önce -20 oC'de saklanan) ekleyerek numune başına 4 mikrotüp (tüp #1'deki hücreler için iki mikrotüp ve tüp #2'deki hücreler için iki mikrotüp) hazırlayın ve buz üzerinde tutun. Not: Nihai etanol konsantrasyonu %50 olacaktır.
- Soğuk etanol içeren 4 tüpün her birine ~ 800 μl hücre süspansiyonunu (tüp # 1 ve tüp # 2'den) pipetleyin ve numuneleri karıştırmak için tüpleri ters çevirin.
- Tüpleri her 5 dakikada bir ters çevirirken tüpleri 15 dakika buz üzerinde inkübe edin.
- Fiksasyon / geçirgenlikten sonra, tüpleri 1,700 x g'da 4 ºC'de 4 dakika santrifüjleyin ve süpernatanı atın. Hücre kaybını önlemek için 50 μl çözelti bırakın.
NOT: Bu aşamadaki peletler beyazdır ve geçirgenlikten öncekine göre tüplerin duvarına daha az yapışır. Bu nedenle, pelet olmayan mikrotüpün duvarına dokunarak süpernatanı dikkatlice çıkarın ve süpernatanı bir mikropipet kullanarak yavaşça yukarı çekin.
5. Hücre Filtrasyonu
- Peletleri soğuk PBS ile adım 4.4'ten itibaren aşağıdaki gibi yeniden askıya alın:
- Tüp #1'den gelen iki mikrotüpten birine 550 μl soğuk PBS ekleyin ve hücre süspansiyonunu 5 kez yukarı ve aşağı nazikçe pipetlemek için orta derecede büyük çaplı bir pipet ucu kullanın. Tüp #2'den gelen bir mikrotüp için de aynısını tekrarlayın.
- Tüp #1'deki hücreler için, aynı pipeti kullanarak, ilk hücre süspansiyonunu ikinci pelete aktarın. Kombine hücre süspansiyonunu 5 kez yukarı ve aşağı nazikçe pipetleyerek ikinci peleti yeniden süspanse edin.
- Tüp #2'deki hücreler için, peletleri (yani, üçüncü ve dördüncü mikrotüpler) 5.1.2'de açıklandığı gibi yeniden süspanse edin ve birleştirin.
