$$\rightleftharpoonup{xx}$$
$$\longleftharp{xx}$$,
$$\longrightharp{xx}$$,
Hayvan örneklerini içeren tüm prosedürler, uygun hayvan etik inceleme komitesi tarafından gözden geçirilmiş ve onaylanmıştır.
1. Fare beyin zarlarının hazırlanması
- Bir giyotin aparatı kullanarak farenin kafasını kesin ve beynini hızlı bir şekilde inceleyin (diseksiyon işlemi sırasında meydana gelebilecek palmitoilasyon değişikliklerini en aza indirmek için mümkünse <1 dakika içinde). Buz üzerinde bir cam homojenizatörde (~12 vuruş) 10 mL homojenizasyon tamponunda (Tablo 1) hemen homojenize edin.
- Lizatları 4 ° C'de 1.400 x g'da 15 dakika santrifüjleyin. Süpernatanı buz üzerindeki yeni bir tüpe aktarın. Peleti (~ 6 vuruş) eşit hacimde homojenizasyon tamponunda yeniden süspanse edin ve 4 ° C'de 10 dakika boyunca 710 x g'da santrifüjleyin.
- Adım 1.2'deki süpernatanları birleştirin ve 4 ° C'de 20 dakika boyunca 40.000 x g'da santrifüjleyin.
- Süpernatanı (sitozolik fraksiyon) atın ve peletlenmiş membran (P2) fraksiyonunu homojenizasyon tamponunda yeniden süspanse edin.
not: Numuneler hızlı dondurulabilir ve daha sonra kullanılmak üzere -80 °C'de saklanabilir.
- Protein seviyelerini ölçmek için bir bikinkoninik asit (BCA) testi yapın. Asil-PEGil değişim jel kayması (APEGS) testi için, 1.5 mL'lik bir tüpte 470 μL tampon A (Tablo 1) hacminde ~ 100−200 mg protein (maksimum 250 mg) ile başlayın. Çözünmeyen proteini çıkarmak için 25 ° C'de 10 dakika boyunca >13.000 x g'da sonikat ve santrifüjleyin. Çözünmüş proteini yeni bir 1.5 mL tüpe aktarın.
2. Asil-PEGil değişimi jel kayması (APEGS) testi
- Disülfür bağlarını bozun ve serbest sisteinleri bloke edin.
- 25 mM tris (2-karboksietil) fosfin (TCEP; 25 μL, bir stok çözeltisinden eklenir; Tablo 1) 55 ° C'de 60 dakika boyunca.
- 50 mM N-etilmaleimid (NEM; 12.5 μL, bir stok çözeltisinden eklenir; Tablo 1) 3 h.
için oda sıcaklığında
not: Reaksiyon gece boyunca uzatılabilir.
- Kloroform metanol (CM) çökeltme işlemini gerçekleştirin.
- Protein çözeltisini 1.5 mL'lik tüpten, sallanan bir kova rotorunda mütevazı bir hızda santrifüjlenebilen bir polipropilen veya cam tüpe aktarın. 5 mL'lik bir tüp idealdir. Dört hacim (2 mL) metanol (MeOH) ekleyin ve kısaca girdap yapın.
- İki hacim (1 mL) kloroform ekleyin ve kısaca girdap yapın.
- Üç hacim (1.5 mL) deiyonize su (dH2O) ekleyin ve kısaca girdaplayın.
- Numuneleri 3.000 x g'da 30 °C'de 25 dakika boyunca sallanan bir kova rotorunda santrifüjleyin.
- Üst fazı dikkatlice çıkarın ve atın.
- 3 hacim (1.5 mL) MeOH ekleyin ve opak proteinli krepi parçalamamaya dikkat ederek nazikçe ama iyice karıştırın.
- Sallanan bir kova rotorunda 25 ° C'de 10 dakika boyunca 3.000 x g'da santrifüjleyin.
- Bir cam serolojik pipet kullanarak, protein krepini bozmadan üst fazın mümkün olduğunca çoğunu çıkarın.
- Peleti 1 mL MeOH ile dikkatlice durulayın.
- Peleti en az 10 dakika havayla kurutun
not: Kurutulmuş pelet -20 °C'de saklanabilir.
- Hidroksilamin (NH2OH, HAM) ile palmitoil-tiyoester bağlarının bölünmesini gerçekleştirin.
- Protein çökeltisini 125 μL tampon A'da yeniden süspanse edin ve kısaca sonikat yapın. Çözünmeyen materyali çıkarmak için >13.000 x g'da 25 ° C'de 10 dakika santrifüjleyin. Çözünmüş proteini yeni bir 1.5 mL tüpe aktarın.
- 375 μL tampon H (HAM +; Tablo 1) veya tampon T (HAM-; Tablo 1) ve numuneleri 25 ° C'de 60 dakika inkübe edin.
- Adım 2.2.
'da açıklanan CM çökelmesini tekrarlayın
not: Kurutulmuş pelet -20 °C'de saklanabilir.
- Korumasız sisteinlere mPEG ekleyin.
- Pelet, 10 mM TCEP içeren 100 μL tampon A'da yeniden süspanse edin. 1,5 mL'lik bir tüpe aktarın.
not: CM çökeltme adımları sırasında önemli miktarda protein kaybının meydana gelmesi normaldir. Sonraki tüm adımlar, protein hacmini maksimum ~ 120−130 μL ile sınırlayan 1.5 mL'lik bir tüpte gerçekleştirilecektir. Bu, son CM çökeltmesi sırasında protein kaybını azaltacaktır.
- 20 mM mPEG-5k (25 μL, bir stok çözeltisinden eklenir; Tablo 1) protein örneğine ve pipetleme ile karıştırın. Uçtan uca rotasyonla 25 ° C'de 60 dakika inkübe edin.
- Dahil edilmemiş mPEG-5k'yi çıkarmak için, bu ayarlanmış hacimleri kullanarak adım 2.2'de açıklandığı gibi CM çökeltmesini gerçekleştirin: 4 hacim MeOH (500 μL), 2 hacim kloroform (250 μL) ve 3 hacim dH2O(375 μL). 25 ° C'de 10 dakika boyunca >13.000 x g'da santrifüjleyin.
- Kalın, topaklanan kreplerden kaçınarak üst fazı daha önce olduğu gibi dikkatlice çıkarın. 1 mL MeOH ekleyin ve nazikçe ama iyice karıştırın. 25 ° C'de 10 dakika boyunca >13.000 x g'da santrifüjleyin.
- Süpernatanı dikkatlice çıkarın ve peleti 1 mL MeOH ile durulayın. 25 ° C'de 10 dakika boyunca >13.000 x g'da santrifüjleyin. Havayla kuruyan pelet.
>not: Kurutulmuş pelet -20 °C'de saklanabilir.
- Kurutulmuş peleti 50 μL tampon A içinde (TCEP veya herhangi bir indirgeyici madde olmadan) yeniden süspanse edin.