Alzheimer Hastalığının Modellenmesi için Amiloid-Beta Salınan Polimer Mikro Boncukların İmalatı

Özet

Kaynak: Almari, B., et al. Alzheimer Hastalığının Modellenmesinde Kullanılmak Üzere Amiloid β Salgılayan Aljinat Mikroboncuklarının İmalatı. J. Vis. Uzm. (2019).

Bu video, nörotoksik amiloid-beta salgılayan hücreleri kapsülleyen polimer mikro boncukların üretilmesi için bir yöntemi göstermektedir. Hücre-polimer süspansiyonu, kalsiyum çapraz bağlama yoluyla elde edilen polimer jelleşmesi ile bir mikroboncuk üretim cihazı aracılığıyla işlenir ve hücrelerin etrafında küresel mikro boncuklar oluşturur. Polimer, hücre çoğalmasına izin verirken, kontrollü, uzun süreli amiloid-beta salınımına izin vererek Alzheimer hastalığındaki birikimini simüle eder.

Protokol

1. Hazırlıklar

1. 100 mL ~% 4 (a / h) aljinat stok çözeltisi hazırlayın.
   1. 4.4 g aljinat sodyum tuzunu tartın ve kuru tozu 100 mL HEPES tamponlu saline (HBS, 20 mM hidroksietilpiperazin etan sülfonik asit [HEPES] (0.477 g) 150 mM NaCl (0.877 g) ile deiyonize suya ekleyin ve hidrasyona izin verir.
   2. Dakikada ~500 devirde (rpm) manyetik bir karıştırıcı kullanın ve tam aljinat hidrasyonu sağlamak için 50 °C'ye kadar ısıtın.
      not: Aljinatın tamamen sulanması için bir veya iki saate ihtiyacı olabilir. Zamandan tasarruf etmek için, aljinat çözeltisi kapsülleme protokolünden bir gün önce hazırlanabilir ve ertesi güne kadar 4 ° C'de saklanabilir. Aljinat soğutulduğunda, bir su banyosu veya sıcak plaka kullanarak hafifçe 37 °C'ye ısıtın ve kullanmadan hemen önce manyetik bir karıştırıcı ile çalkalayın.
   3. Kullanmadan önce 0,22 μm gözenekli polietersülfon (PES) filtre kullanarak aljinat solüsyonunu steril filtreleyin. Aljinatın kolay akışını sağlamak için 37 °C'de filtreleme önerilir. Sıcaklığın düşmesine izin verilirse viskozite artacaktır.
2. 1.000 mL 0,5 M CaCl₂ hazırlayın.
   1. 55.49 g susuz CaCl₂ ağırlığında ve 1.000 mL HBS'de (1.000 mL deiyonize suda 20 mM HEPES ve 150 mM NaCl) çözün.
   2. 0,22 μm gözenekli PES filtre kullanan steril filtre.
3. 100 mL çözünme karışımı hazırlayın.
   1. Fosfat tamponlu salin içinde 100 mM HEPES (23.83 g) ve 500 mM trisodyum sitrat dihidrat (147.05 g) çözeltisi hazırlayın.
   2. NaOH veya HCl kullanarak pH 7.4'e ayarlayın.

2. Kapsülleme sisteminin kurulması

1. Laminer akış başlığını temizleyin.
   1. Kapsülleyiciyi içeren laminer akış başlığını UV'ye maruz kalarak sterilize edin ve ardından %70 v/v etanol çözeltisi püskürtün.
   2. Kapsülleyici sistemini 10 mL %70 v/v etanol çözeltisi ve ardından 10 mL steril deiyonize su ile yıkayın.
   3. 300 μm'lik nozulu takın ve 2.1.2 adımını tekrarlayın.
   4. Filtrelenmiş aljinat çözeltisinin bulunduğu şişeye, filtrelenmiş kalsiyum klorür çözeltisinin bulunduğu şişeye ve %70 v/v etanol çözeltisi ile kullanılacak her türlü alet, ekipman ve boş kültür plakalarına püskürtün ve laminer akış başlığına yerleştirin. Kullanmadan önce, iyice sterilize etmek için UV ışığını 30 dakika boyunca tekrar açın.
   5. Biyolojik dereceli bir dezenfektan solüsyonu ile doldurulmuş bir atık kabı hazırlayın ve kabı davlumbazın içine yerleştirin.
   6. Bir kabı 100 mL steril CaCl₂ (sulu) çözelti ile doldurun ve manyetik bir karıştırıcı ekleyin. Karıştırma hızını 100 rpm'ye ayarlayın. Beheri, nozulun ucundan 18 cm yükseklikte manyetik bir platform üzerine yerleştirin. Bu beher, aljinat boncukları toplamak ve jelleşmelerine izin vermek için kullanılacaktır.
2. Hücreleri kapsülleme için hazırlayın.
   1. Hücreleri inkübatörden çıkarın ve %0.25 tripsin-etilendiamintetraasetik asit (EDTA) çözeltisi kullanarak birleşen şişeden ayırın ve 37 ° C'de 5-10 dakika inkübe edin.
   2. Hücre yoğunluğunun tahmini için bir numuneyi izole edin ve ardından bir hücre peleti elde etmek için kalan hücreleri 5 dakika boyunca 1.000 rpm'de santrifüjleyin.
   3. İstenen nihai hücre konsantrasyonunu iki katına çıkarmak için peleti HBS'de (20 mM HEPES ve 150 mM NaCl) yeniden süspanse edin (ör., 1.5 x 10⁶ hücre / mL'lik bir nihai konsantrasyon için, 3 x 10⁶ hücre / mL'lik bir konsantrasyon elde etmek için hücreleri HBS'de yeniden süspanse edin).
   4. 50 mL'lik bir santrifüj tüpünde, istenen hücre konsantrasyonunu içeren nihai bir süspansiyon elde etmek için hücre süspansiyonunu 1: 1 oranında ~% 4 (a / h) aljinat çözeltisi ile karıştırın (ör., 1.5 x 10⁶ hücre / mL) ~% 2 (a / h) aljinat çözeltisinde.
3. Kapsülleme parametrelerini ayarlayın.
   1. Kapsülleme makinesinin hızını maksimum ekstrüzyon hızına (8,9 mL/dak), voltajı 1,0 kV'a ve frekansı 5,500 Hz.
      'a ayarlayın not: Bu parametreler daha önce 550 μm çapında mikro boncuklar elde etmek için optimize edilmişti.

3. Fabrikasyon

1. Mikro boncukları üretin.
   1. 20 mL'lik bir şırıngaya, 5 mL hücre-aljinat süspansiyonu yükleyin ve kapsülleyiciye bir şırınga takın.
   2. Hücre-aljinat süspansiyonunu besleyiciden itecek akışı etkinleştirerek kapsülleyiciyi başlatın. Nozuldan bir damlacık akışı ekstrüde edilecektir.
   3. İlk homojen olmayan akışı önlemek için ilk 1 mL'yi atık beherde toplayın.
   4. Damlacıkların CaCl₂ jelleşme banyosuna düşmesine izin vererek kalan 4 mL'yi çalıştırmaya devam edin. Her mililitre ayrı ayrı (ancak art arda) çalıştırılabilir ve gerekirse dört farklı jelleşme banyosunda toplanabilir.
      not: Jelleşme banyosu ile temas ettiğinde, damlacıklardaki aljinat, jelleşme banyosundaki kalsiyum iyonları ile anında çapraz bağlanacak ve küresel mikro boncuklar oluşturacaktır.
   5. Bir dakika sonra, jelleşme kabını manyetik platformdan çıkarın ve mikro boncukların çalkalanma olmadan 4 dakika daha oturmasına izin verin (oda sıcaklığında mikro boncuklar boyunca tam jelleşmeye izin vermek için gereken süre).
2. Mikro boncukları alın.
   1. Bir çift steril cımbız kullanarak büyük aljinat kalıntılarını veya artefaktları çıkarın ve ardından jelleşme banyosundan mikro boncukları almak için 74 μm'lik bir gözenekli filtreye aktarmak için steril bir plastik pipet kullanın.
   2. Mikro boncukları uygun kültür ortamını kullanarak bir santrifüj tüpüne aktarın ve hücre kültürü ortamında 5 dakika dengelenmelerine izin verin.
   3. Kuluçka ve daha sonraki deneyler için bir şişeye, tabağa veya Petri kabına aktarın.
      not: Jelleşme banyosu tekrar kullanılmamalıdır.

Malzemeler

Bu makalede kullanılan malzemelerin listesi

Ad	Şirket	Katalog numarası	Yorumlar
0.22 um PES filter	Merck, Birleşik Krallık	SLGP033RS
15mm Netwell insert 74 um mesh filtre	Constar, Amerika Birleşik Devletleri	#3477
Kahverengi alglerden elde edilen aljinik asit sodyum tuzu	Sigma-Aldrich,İngiltere	A0682
Kalsiyum klorür	Sigma-Aldrich,İngiltere	C1016
CellTiter96 AQueous One Solution hücre proliferasyon testi	Promega, Amerika Birleşik Devletleri	G3580
Kapsülleyici	Inotech	IE-50	seri no. 05.002.01-2005
HEPES	Sigma-Aldrich,İngiltere	H4024
Fosfat tamponlu tuzlu su	Sigma-Aldrich,İngiltere	D1408
Sodyum klorür	Sigma-Aldrich,uk	433209
Trispdium sitrat dihidrat	Sigma-Aldrich,Birleşik Krallık	W302600-K
Tripsin-EDTA çözümü	Sigma-Aldrich,İngiltere	T4049