$$\rightleftharpoonup{xx}$$
$$\longleftharp{xx}$$,
$$\longrightharp{xx}$$,
Hayvan modellerini içeren tüm prosedürler, yerel kurumsal hayvan bakım komitesi ve JoVE veteriner incelemesi
tarafından gözden geçirilmiştir.
Not: Hedef fare popülasyonunu belirleyerek başlayın. Önceki çalışmalarda, sadece erkek vahşi tip C57 / Bl6 fareleri kullanılmıştır. Bununla birlikte, çeşitli transgenik veya nakavt fareler de kullanılabilir. Stereotaktik koordinatların C57/Bl6 anatomisine dayandığını unutmayın. Her kullanıcının başlangıçta konturun beyaz maddeye lokalizasyonunu doğrulaması önerilir.
1. Beyaz Madde Strok İndüksiyonu - Medial Açılı Yaklaşım
- Distal çapı 15-25 μm arasında olan 0,5 mm'lik bir kılcal tüp kullanarak çekilmiş bir cam pipet hazırlayarak başlayın.
- Steril% 0.9 normal salin içinde 27.4 mg / ml'de (130 μM) steril 10 μl L-Nio (N (5) - (1) -iminoetil-L-ornitin hidroklorür) hazırlayın.
- Çekilen cam pipeti küçük bir hacimde L-Nio (2-5 μl) ile önceden doldurun ve cam pipeti bir vakum hattına bağlı boruya takın. Pipeti tezgahın üzerine düz bir şekilde yerleştirin ve çekilen ucu L-Nio solüsyonuna yerleştirin.
- Pipetin 2 mm'lik kısmının en az 0.5 mm'si dolana kadar vakumu uygulayın. Vakumu kapatın ve pipeti geri çekin. Adım 1.12'ye kadar bir kenara koyun.
- Fareyi bir indüksiyon odasına yerleştirin ve bir buharlaştırıcıdan (5 L / dk oksijen ve 0.5 L / dk nitrojen ile solunan 5 L / dk) akan standart% 32 izofluran kullanarak farenin anestezisini 1 dakika boyunca veya derin anestezi uygulanana kadar indükleyin. Fareyi stereotaktik mikroskop ile donatılmış stereotaktik bir cihaza aktarın. Bir buharlaştırıcıdan (5 L / dak oksijen ve 0.5 L / dak nitrojen ile solunan 2 L / dak) ve bir burun konisinden akılan% 32 izofluran kullanarak idame anestezisi sağlayın. Anestezi derinliğini bir ayak parmağı tutamıyla kontrol edin.
- Enjeksiyon kolunu 36°'ye ayarlayın.
- Düşük hacimli basınçlı enjeksiyon sisteminin distal ucuna çekilmiş bir cam pipet tutucu takın ve stereotaktik kurulumun enjeksiyon koluna takın.
- Anestezi uygulanmış hayvanın bıyıklarını vazelin ile kaplayın ve her iki gözün üzerine suni gözyaşı merhemi sürün. Başın üzerinde 5-10 cm'lik bir açıklık olacak şekilde hayvanın başının üzerine steril bir örtü yerleştirerek steril bir cerrahi alan hazırlayın. Kafatasının üzerindeki kürkü tıraş ederek aseptik bir cerrahi yüzey hazırlayın. Saç derisini alternatif betadin ve% 70 alkollü bezlerle temizleyin.
- Kafatası yüzeyini ortaya çıkarmak için steril ince makasla 1,5 cm'lik orta hat kafa derisi kesisi yapın. Kafatasını steril bir pamuklu çubukla kurulayın ve 1-3X büyütmede stereotaktik bir mikroskop kullanarak, steril bir mikro nokta aleti kullanarak üstteki periosteal dokuyu çıkarın.
- İnce nokta işaretleyicisi kullanarak Bregma'yı referans noktası olarak işaretleyin.
- Bregma'dan arkaya doğru başlayan ve orta hattın hemen solunda öne doğru uzanan steril, ince uçlu bir cerrahi matkap ucu kullanarak 2 mm'lik bir eliptik kraniotomi delin. Serebral korteksin görüntülenebilmesi için kemik parçalarını ve üstteki yumuşak dokuyu çıkarın.
- Aralıklı olarak steril salin damlaları uygulayarak cerrahi alanı ve kortikal yüzeyi nemli tutun.
- Stereotaktik aparatın enjektör koluna çekilmiş bir cam pipet takın. Pipetin distal ucunu Bregma ile hizalayın ve stereotaktik koordinatları sıfırlayın.
- Pipeti Tablo 1'da verilen ilk ön/arka (A/P) ve medial/lateral (M/L) koordinatlarına ilerletin.
- Pipeti kortikal yüzeye ilerletin ve dorsal/ventral (D/V) ölçümünü sıfırlayın.
- Tablo 1'deki ilk D/V koordinatına ulaşana kadar pipeti yavaşça beyne geçirin.
- 20 msn darbeler için 20 psi'ye ayarlanmış düşük hacimli bir basınçlı enjeksiyon sistemi kullanarak, beyne 100 nl L-Nio enjekte edin ve pipet yolunda geri akışı önlemek için 5 dakika bekleyin.
- Stereotaktik mikroskobun göz merceğinde kalibre edilmiş bir retikül ve 3X büyütme kullanın.
- Buna göre, her koordinat seti için çekilen cam pipetten toplam 0,100 mm3 (0,5 mm çapında bir pipette 0,5 mm uzunluk, 100 nl'ye karşılık gelir) yer değiştirin. Bir retikül kullanarak, her kurulum kullanılan büyütme ve ölçeklere bağlı olarak değiştiğinden ölçün ve standartlaştırın.
- Her enjeksiyon sırasında doğru hacim ölçümü için, hava sıvısı menisküsünün sagital bir görünüme sahip olması için mikroskopla açılı pipete yandan yaklaşın. Menisküs, pipetin hem iç hem de dış duvarlarının aynı odak düzleminde görünmelidir.
- Pipeti yavaşça geri çekin ve Tablo 1'da verilen ikinci ve üçüncü koordinat kümesinde 1.13-1.16.3 adımlarını tekrarlayın.
- Son enjeksiyondan sonra, pipeti çıkarın ve kraniyotomi bölgesini dolduracak kadar kemik mumu yerleştirin. Kafa derisinin kenarlarını yaklaşık olarak yaralayın ve dermal yapıştırıcı ile bağlayın.
- Kafa derisi insizyonu ile ilişkili lokal ağrıyı önlemek için steril bir 30 G iğne kullanarak yara kenarlarına 0.1 ml% 0.5 Marcaine enjekte edin.
- Hayvanı yuvasına geri koyun ve 5 gün boyunca içme suyuna ameliyat sonrası antibiyotikler (0.48 mg / ml trimetoprim-sülfametoksazol veya 0.5 mg / ml Levofloksasin) verin.
