Drosophila Larvalarında Protein-Protein Etkileşimlerinin Yakınlık Ligasyon Testi Kullanılarak Saptanması

Özet

Kaynak: Wang, S., et al. Drosophila Larva Nöromüsküler Kavşakta In Situ Protein-Protein Komplekslerinin Yakınlık Ligasyon Testi Kullanılarak Saptanması. J. Vis. Uzm. (2015).

Bu video, Yakınlık Ligasyon Testi (PLA) kullanılarak Drosophila nöromüsküler kavşakta (NMJ) protein-protein etkileşimlerinin görselleştirilmesini göstermektedir. Vücut duvarlarını izole ettikten sonra, etkileşen proteinler birincil antikorlar ve PLA ile konjuge ikincil antikorlar ile incelenir. Etkileşen proteinlerin yakınlığı, probların konektör oligonükleotidleri ile bağlanmasını kolaylaştırır, dairesel DNA oluşturur ve bu daha sonra yuvarlanan daire amplifikasyonu ile amplifiye edilir. Floresan problar, amplifiye edilmiş DNA'ya bağlanarak NMJ'deki protein-protein etkileşimlerinin görselleştirilmesine izin verir.

Protokol

1. Vücut Duvarı Hazırlığı

NOT: Üçüncü instar larva vücut duvarlarının hazırlanması (vücut duvarı kaslarını innerve eden NMJ'lerin incelenmesi için) daha önce tarif edildiği gibi ancak bazı modifikasyonlarla gerçekleştirildi.

1. Diseksiyonu
   1. Standart prosedürleri kullanarak sinek stoklarını ve çaprazları beş ila altı gün boyunca 25 ° C'de yükseltin.
   2. İnce forseps kullanarak sürünen üçüncü instar larvalarını şişelerden veya şişelerden toplayın.
   3. Yiyecek parçacıklarını gidermek için larvaları Fosfat Tampon Salin (PBS) içeren küçük bir Petri kabında yıkayın.
   4. Tek bir larvayı bir sylgard diskine yerleştirin ve birkaç damla buz gibi soğuk PBS'ye daldırın. Buz gibi soğuk PBS kullanmak, larvaları sersemletmeye yardımcı olacak ve manipüle etmeyi kolaylaştıracaktır. Diseksiyon boyunca, kurumasını önlemek için preparatın her zaman PBS'ye batırıldığından emin olun.
   5. Larvaları, dorsal tarafı yukarı bakacak şekilde, iki trakeal kanal diseksiyon mikroskobu altında görünecek şekilde konumlandırın (Şekil 1A). Bir minutien pimini kavramak için forsepsleri kullanarak, larvaları spiracles'ın yakınındaki arka uçta sabitleyin (Şekil 1B). Başka bir pim ile, ağız kancalarının yakınındaki ön uçtaki kütikülü delin. Larvayı yavaşça uzunlamasına gerin, ardından sabitleyin (Şekil 1B).
   6. Mikrodiseksiyon makası kullanarak, küçük bir açıklık oluşturmak için arka ucu pimin yakınında sıkıştırın. Kesi, sadece kütikülden geçecek kadar yüzeysel olmalıdır.
   7. Makasın alt bıçağının ucunu insizyona yerleştirerek, iki trakeal yol arasındaki dorsal orta hattın tüm uzunluğu boyunca kesin (Şekil 1C). Ventral gövde duvarı kaslarına zarar vermemek için kesim sırasında makas bıçaklarını hafifçe yukarı doğru tutun.
   8. Arkaya yerleştirilen pimin biraz önünde küçük bir yatay kesi yapın (Şekil 1C). Öne yerleştirilen pimin biraz arkasında benzer bir kesi daha yapın (Şekil 1C). Kesiler sadece kütikülden geçmelidir.
      NOT: 1.1.7 ve 1.1.8 adımlarındaki üç kesi tamamlandığında bir "" ye benzemelidir, yani , larva gövdesinin sırt tarafında bir sol ve sağ el flebi oluşturulmalıdır.
   9. İç organları forseps ile dikkatlice temizleyin. Birkaç güçlü PBS damlası eklemek, organların larva gövdesinden çıkarılmasına yardımcı olacak ve böylece çıkarılmasını kolaylaştıracaktır. Vücut duvarı kaslarına zarar vereceği için larva gövdesini dürtmekten kaçının.
   10. Larva gövdesini açın ve köşeleri aşağı doğru sabitleyin (Şekil 1D). Sabitlerken, eşit şekilde gerilmiş bir dikdörtgen oluşturmak için vücut duvarını hem yatay hem de dikey olarak gerin (şekil için bkz. Şekil 1G), işlem sırasında vücut duvarı kaslarını yırtmamaya dikkat edin.
   11. Kalan iç organları çıkarmayı bitirin (Şekil 1E).
2. Fiksasyon ve Geçirgenlik
   1. Sabitlenmiş gövde duvarlarını birkaç damla Bouin's Solution'a batırın. Buz üzerinde 15 dakika inkübe edin. Alternatif olarak, alternatif bir fiksatif olarak %4 paraformaldehit (PFA) kullanın; 30 dakika kuluçkaya yatırın.
   2. Tritonlu Fosfat Tampon Salin (PBT) ile üç kez durulayın.
   3. İnce forseps kullanarak, pimleri dikkatlice çıkarın ve gövde duvarlarını köşelerinden silikonlu 0.65 ml'lik bir mikrosantrifüj tüpüne aktarın.
   4. Gövde duvarlarını PLA için hazır olana kadar 4 °C'de PBT'de saklayın. En iyi sonuçlar için, diseksiyondan bir veya iki gün sonra vücut duvarlarını immün boyamaya başlayın.
      NOT: Reaktiflerden tasarruf etmek ve test sırasında tüm vücut duvarlarının eşit şekilde muamele görmesini sağlamak için farklı genotipler tek bir tüpe yerleştirilebilir. Genotipler, vücut duvarlarının köşelerinin farklı şekilde kesilmesiyle ayırt edilebilir (örneğin bkz. Şekil 1F).

2. İmmünohistokimya

NOT: Üçüncü instar larva vücut duvarlarının immün boyaması daha önce tarif edildiği gibi ancak bazı modifikasyonlarla gerçekleştirilmiştir.
NOT: Aksi belirtilmedikçe tüm adımları oda sıcaklığında ve hafif çalkalama ile gerçekleştirin.

1. Engelleme
   1. Vücut duvarlarını PBT ile her biri 10 dakika boyunca üç kez yıkayın.
   2. 1 saat boyunca% 1 Sığır Serum Albümini (BSA) ile bloke edin.
2. İmmün boyama
   1. Vücut duvarlarını, ilgilenilen iki proteine (% 1 BSA içinde seyreltilmiş) karşı fare ve tavşan birincil antikorları ile oda sıcaklığında 2 saat veya gece boyunca 4 ° C'de inkübe edin. Bu durumda, 1:10 fare anti-Dlg (Dlg = büyük diskler) ve 1:250 tavşan anti-HtsM (HtsM: Hu-li tai shao mutant) kullanın. Fare veya tavşanda yapılmayan belirteçlere karşı antikorlar da dahil edilebilir - , örneğin , nöronal zarları tanımlamak için 1:200 keçi anti-HRP (Hrp = yaban turpu peroksidaz) kullanın.
   2. PBT ile her biri 10 dakika boyunca üç kez yıkayın.
   3. Oda sıcaklığında 2 saat veya gece boyunca 4 ° C'de belirteçleri (% 1 BSA içinde seyreltilmiş) tespit etmek için florofor konjuge ikincil antikorlarla inkübe edin. PLA sinyali daha sonra kırmızı bir florofor ile görselleştirildiğinden, işaretleyiciyi tespit etmek için başka bir florofor kullanılmalıdır - , örneğin , keçi anti-Hrp antikorunu tespit etmek için 1:200 Floresein izotiyosiyanat (FITC) konjuge anti-keçi kullanın. Işığa duyarlı reaktiflerin kullanılması nedeniyle, tüpleri bu noktadan itibaren karanlıkta tutun.
      NOT: Kullanılan kit, fare ve tavşanda ortaya çıkan primer antikorlar arasında PLA'nın gerçekleştirilmesine izin verir ve sinyal, konfokal mikroskopi altında kırmızı kanalda görselleştirilir. İstenirse, tahlilin diğer türlerde yükseltilmiş primer antikorlar ve diğer kanallarda görselleştirilen sinyal ile yapılmasına izin veren başka kitler de mevcuttur.

3. Yakınlık Ligasyon Testi

NOT: Aksi belirtilmedikçe tüm adımları oda sıcaklığında ve hafif çalkalama ile gerçekleştirin.

1. PLA Probları
   1. Vücut duvarlarını PBT ile her biri 10 dakika boyunca üç kez yıkayın.
   2. 37 ° C'de 2 saat boyunca PLA probları (her biri% 1 BSA'da 1: 5 seyreltme) ile inkübe edin. Bu durumda, 5-10 vücut duvarının uygun şekilde daldırılmasını ve karıştırılmasını sağlamak için 40 μl PLA probu anti-fare MINUS, 40 μl PLA probu anti-tavşan PLUS ve 120 μl %1 BSA kullanın. PLA problarının 1:25'e kadar seyreltilmesi yine de yeterli bir sinyal-gürültü oranı ile sonuçlanabilir (bu deney için , yani ).
2. Ligasyon
   1. Gövde duvarlarını Yıkama Tamponu A ile her biri 5 dakika boyunca iki kez yıkayın.
   2. 37 ° C'de 1 saat boyunca Ligasyon çözeltisi (Ligasyon tamponunda Ligazın 1:40 seyreltilmesi) ile inkübe edin. Bu durumda, 5-10 vücut duvarının uygun şekilde daldırılmasını ve karıştırılmasını sağlamak için 5 μl Ligaz, 40 μl 5 Ligasyon tamponu ve 155 μl yüksek saflıkta su kullanın.
3. Amplifikasyon
   1. Gövde duvarlarını Yıkama Tamponu A ile her biri 2 dakika boyunca iki kez yıkayın.
   2. 37 ° C'de 2 saat boyunca Amplifikasyon çözeltisi (Amplifikasyon tamponunda 1:80 Polimeraz seyreltmesi) ile inkübe edin. Bu durumda, 5-10 vücut duvarının uygun şekilde daldırılmasını ve karıştırılmasını sağlamak için 2,5 μl Polimeraz, 40 μl 5 Amplifikasyon tamponu ve 157,5 μl yüksek saflıkta su kullanın.
4. Görüntüleme için Hazırlık
   1. Gövde duvarlarını Wash Buffer B ile her biri 10 dakika boyunca iki kez yıkayın.
   2. 0.01x Yıkama Tamponu B ile 1 dakika boyunca bir kez yıkayın.
   3. Montajdan önce en az 30 dakika boyunca birkaç damla montaj solüsyonunda dengeleyin veya gece boyunca 4 °C'de saklayın.
   4. İnce forsepsler kullanarak, vücut duvarlarını, tırnak etleri aşağı bakacak şekilde bir platform kızağına dikkatlice aktarın. Gövde duvarlarını sıralar halinde ve aynı yönde bir veya iki damla montaj aparatı içinde konumlandırın. Hava kabarcıkları oluşturmamaya dikkat ederek müstahzarın üzerine 22 mm x 40 mm'lik bir lamel yerleştirin, ardından slaytı şeffaf oje ile kapatın.
   5. Slaytları konfokal görüntüleme için hazır olana kadar karanlıkta -20 °C'de saklayın.

Sonuçlar

Şekil 1: Üçüncü instar larva vücut duvarlarının hazırlanması. (A-F) Bir vücut duvarı diseksiyonunu temsil eden şematik çizimler. (A) Tek bir larvayı, iki trakeal yol görünecek şekilde sırt tarafı yukarı bakacak şekilde bir sylgard diskine yerleştirin. (B) Larvaları ön ve arka uçlarda minutien pimlerle sabitleyin, işlem sırasında larvaları uzunlamasına germek.

Malzemeler

Bu makalede kullanılan malzemelerin listesi

Ad	Şirket	Katalog numarası	Yorumlar
Forseps (ince #5)	Doktor	A10-704
Sylgard Diski	Dünya Hassas Aletleri	SYLG184	Elastomer baz ve sertleştirici maddeyi 10:1 oranında karıştırın. 30 dk için ayarlayın. Bir kalıba dökün (örneğin, 12 oyuklu bir hücre kültürü plakası kullanın). En az 24 saat kürlenmeye bırakın. Diseksiyon sırasında 60x15 mm'lik bir petri kabı kapağının kapağına yapıştırın.
Minutien Pimleri (0,0125 mm uç çapı)	Güzel Bilim Araçları	26002-10
Mikrodiseksiyon Makası (ultra ince)	Güzel Bilim Araçları	15200-00
Platform Slaytları			İki adet 22x22 mm'lik lameli boyayı şeffaf oje ile bir mikroskop lamına yapıştırın ve numune montajı için aralarında <20 mm boşluk bırakın.
w1118	Bloomington Drosophila Stok Merkezi	3605
hts01103	Bloomington Drosophila Stok Merkezi	10989	Stok, bir GFP dengeleyici üzerinde yeniden dengelendi, böylece homozigot mutantlar, GFP sinyalinin yokluğuna bağlı olarak seçilebilirdi.
1x PBS (Fosfat Tamponlu Salin): 3mM NaH2PO4, 7mM Na2HPO4, 130mM NaCl, pH 7.0			NaH2PO4 (Caledon Laboratuvarları - 8180-1), Na2HPO4 (Caledon - 8120-1), NaCl (Caledon - 7560-1)
Bouin'in Çözümü	Sigma-Aldrich	HT10132
%4 PFA (Paraformaldehit): 1x PBS'de %4 PFA			PFA (Anakimya Bilimi - 66194-300). Çözümün nasıl yapılacağına ilişkin talimatlar için doi:10.1101/pdb.rec9959 Cold Spring Harb Protoc 2006'ya bakın.
1x PBT (Tritonlu Fosfat Tamponlu Salin): %0,01 Triton ile 1x PBS			Triton X-100 (Sigma-Aldrich - T8787)
% 1 BSA (Sığır Serum Albümini): 1x PBT'de% 1 BSA			BSA (Biyoshop Kanada - ALB001). 4 °C'de saklayın.
mouse anti-Dlg (Büyük diskler)	Gelişim Çalışmaları Hibridoma Bankası	4F3	% 1 BSA'da 1:10 seyreltmede kullanın.
tavşan anti-HtsM (Hu-li tai shao)			Dr. Lynn Cooley (Yale Üniversitesi) tarafından sağlanmıştır. % 1 BSA'da 1:250 seyreltmede kullanın.
tavşan anti-Pak (p21 ile aktive olan kinaz)			Dr. Nicholas Harden (Simon Fraser Üniversitesi) tarafından sağlanmıştır. % 1 BSA'da 1:500 seyreltmede kullanın.
fare anti-Wg (Kanatsız)	Gelişim Çalışmaları Hibridoma Bankası	4D4	% 1 BSA'da 1: 5 seyreltmede kullanın.
keçi anti-HRP (Yaban turpu peroksidaz)	Jackson İmmünoAraştırması	123-065-021	% 1 BSA'da 1:200 seyreltmede kullanın.
FITC konjuge eşek anti-keçi	Jackson İmmünoAraştırması	705-095-003	% 1 BSA'da 1:200 seyreltmede kullanın.
Duolink Yerinde PLA Probu anti-fare MINUS	Sigma-Aldrich	DUO92004
Duolink Yerinde PLA Probu tavşan önleyici PLUS	Sigma-Aldrich	DUO92002
Duolink Yerinde Algılama Reaktifleri Kırmızı	Sigma-Aldrich	DUO92008
1x Yıkama Tamponu A: 0.01M Tris, 0.15M NaCl, %0.05 Tween 20, pH 7.4	Sigma-Aldrich	DUO82049	Tris (Caledon Laboratuvarları - 8980-1), NaCl (Caledon - 7560-1), Tween 20 (Fisher Scientific - BP337)
1x Yıkama Tamponu B: 0.2M Tris, 0.1M NaCl, pH 7.5	Sigma-Aldrich	DUO82049	Tris (Caledon Laboratuvarları - 8980-1), NaCl (Caledon - 7560-1)
0.01x Yıkama Tamponu B: 2mM Tris, 1mM NaCl, pH 7.5	Sigma-Aldrich	DUO82049	Tris (Caledon Laboratuvarları - 8980-1), NaCl (Caledon - 7560-1)
DAPI ile Duolink Yerinde Montaj Ortamı	Sigma-Aldrich	DUO82040