İzole Mitokondrinin Kalsiyum Tutma Kapasitesinin Belirlenmesi

Özet

Kaynak: Li, W., et. al. Mitokondriyal Ca2+ Tutma Kapasitesi Testi ve Ca2+ ile tetiklenen Mitokondriyal Şişme Testi. J. Vis. Uzm. (2018)

Bu video, mitokondri alımı kalsiyum olarak floresandaki gerçek zamanlı değişiklikleri izleyerek mitokondriyal kalsiyum tutma kapasitesini değerlendirme prosedürünü göstermektedir. Bu test, apoptoz ve nörodejeneratif hastalıklar dahil olmak üzere mitokondriyal fonksiyon ve kalsiyumla ilgili süreçleri incelemek için yararlıdır.

Protokol

1. Mitokondriyal Ca²⁺ Tutma Kapasitesinin Belirlenmesi

1. KCl ortamını hazırlayın (125 mM KCl (potasyum klorür), 2 mM K₂HPO₄ (dipotasyum fosfat), 1 mM MgCl₂ (magnezyum klorür), 20 mM HEPES (2- [4- (2-hidroksietil) piperazin-1-il] etansülfonik asit), 5 mM glutamat, 5 mM malat ve 2 μM rotenon, pH 7.4) ve deneyden önce Ca²⁺ bağlayıcı yeşil floresan boyayı 0.5 μM'lik bir nihai konsantrasyona ekleyin.
2. 0.5 μM Ca²⁺ bağlayıcı yeşil floresan boya içeren KCl ortamında 1 mL izole mitokondri (0.4 mg / mL) her 6 oyuklu plaka kuyucuğuna aktarın.
3. Mitokondriyi ve Ca²⁺ bağlayıcı yeşil floresan boyayı 6 oyuklu plakada oda sıcaklığında, 1 dakika boyunca ortam ışığından korunarak inkübe edin. 20 mM CaCl₂ (kalsiyum klorür) çözeltisinin (20 mM CaCl₂, 127 mM KCl, 1 mM MgCl_2, 20 mM HEPES, 5 mM glutamat, 5 mM malat, pH 7.4) 200 nmol Ca²⁺/mg mitokondriyal proteini eklemek için otomatik dağıtım ayarını kullanarak her 6 oyuklu plaka kuyusuna 4 μL alikot ekleyin.
4. 506 nm uyarma dalga boyu ve 531 nm emisyon dalga boyu ile floresan değişikliklerini 2 dakika boyunca her 3 saniyede bir izlemek için bir floresan spektrometresi kullanın. Plaka, yazılım tarafından kontrol edilen okumalar arasında 3 saniye boyunca 600 rpm'de çalkalama ile donatılmıştır (Şekil 1).
5. Her kuyucuğa 20 mM CaCl₂ çözeltisinden 4 μL alikot ekleyin ve floresan değişikliklerini her 3 saniyede bir 2 dakika boyunca izleyin. Floresan zamanla artana kadar bu adımı tekrarlayın.
   NOT: Mitokondri, artan kayıt floresansı ile gösterilen eklenen Ca²⁺ ile zorlanır. mPTP (mitokondriyal geçirgenlik geçiş gözeneği) açıldığında, floresan zamanla artar.
6. mPTP açılana kadar eklenen toplam Ca²⁺ miktarını Ca²⁺ bekletme kapasitesi olarak yorumlayın.

Sonuçlar

Şekil 1: Mitokondriyal Ca²⁺ tutma kapasitesi testi için yazılım ayarları.

Malzemeler

Bu makalede kullanılan malzemelerin listesi

Ad	Şirket	Katalog numarası	Yorumlar
Kalsiyum yeşili-5N	Yaşam Teknolojileri	C-3737	Kalsiyum bağlayıcı yeşil floresan boya
Glutamat	Sigma-Aldrich	RES5063G-A7
Malate	Sigma-Aldrich	46940-U
Rotenone	Sigma-Aldrich	R8875
HEPES	Sigma-Aldrich	H3375
Magnezyum klorür	Sigma-Aldrich	457
Dipotasyum fosfat	Sigma-Aldrich	V900050
KCl	Sigma-Aldrich	P9541
Kalsiyum klorür	Sigma-Aldrich	V900266