$$\rightleftharpoonup{xx}$$
$$\longleftharp{xx}$$,
$$\longrightharp{xx}$$,
Hayvan modellerini içeren tüm prosedürler, yerel kurumsal hayvan bakım komitesi ve JoVE veteriner inceleme kurulu tarafından gözden geçirilmiştir.
1. Mikro-Ozmotik Pompa İnfüzyon Sistemlerinin Hazırlanması
NOT: Pompayı, yapay beyin omurilik sıvısı (aCSF) tamponunu ve ilacı (Met-CCL5/RANTES protein solüsyonu (aCSF'de 10 ng/mL)) steril koşullar altında 0,2 μm filtrelerle filtrelenmiş tamponlar kullanarak hazırlayın ve tüm işlemleri kültür başlığı altında eldivenlerle gerçekleştirin. Ameliyat prosedürleri şu şekilde yapılır:
- Mikro-ozmotik pompaları ameliyattan bir gün önce hazırlayın: Beyin mikro-ozmotik pompasını yapay beyin omurilik sıvısı (aCSF) ile 1 mL'lik bir şırınga ve kit ile birlikte verilen künt başlı iğne ile doldurun. Mikro-ozmotik pompayı aCSF'ye daldırın ve gece boyunca hafifçe sallayarak bir çalkalayıcı üzerine yerleştirin.
DİKKAT: Pompa aCSF ile doldurulmalı ve pompanın içinde hava kabarcıklarından kaçınılmalıdır (Şekil 1A).
- Ameliyata başlamadan önce, deney için rekombinant Met-CCL5 / RANTES protein çözeltisini (10 ng / mL, aCSF içinde seyreltilmiş) hazırlayın. BOS'u pompadan çıkarın ve fazla sızana kadar pompayı ilaç solüsyonuyla yavaşça doldurun.
NOT: 5-8 pompa için 15 mL aCSF veya Met-CCL5/RANTES solüsyonu yeterlidir.
DİKKAT: Pompanın içinde kabarcık olmadan ilaçla tamamen doldurulduğundan emin olmak için prosedürü tekrarlayın.
- Kateter tüplerini istenen uzunlukta kesin ve beyin infüzyon kitinin künt uçlu beyin infüzyon iğnesine takın. İnfüzyon kitini ve tüpleri ilaçla doldurun.
- Son olarak, beyin infüzyon kitini mikro-ozmotik pompaya monte edin ve takın.
DİKKAT: Boruda veya pompada kabarcık oluşmamalıdır (Şekil 1A).
- Pompanın kurumasını önlemek için aCSF'deki tüm ozmotik pompa-beyin füzyon setini sterilize edilmiş 50 mL'lik bir tüpe daldırın. Ozmotik pompa-beyin füzyon seti artık ameliyat için kullanıma hazırdır.
NOT: Mikro-ozmotik pompa sistemleri uzun süreli ilaç infüzyonu için kullanılabilir. Bu, fare beynine güvenli ve uygun bir ilaç verme modu sağlar.
2. İntraserebral Ventriküler Cerrahi – mikro-ozmotik pompanın implantasyonu
DİKKAT: Cerrahi ortamı %75 etanol ile sterilize edin ve çalışmaya katılan kişilerin steril eldiven ve temiz laboratuvar önlüğü giydiğinden emin olun. Cerrahi aletler / aletler kullanımdan önce otoklavlanmalı ve kurutulmalı ve daha sonra fare ameliyatları arasında% 75 etanol ile sterilize edilmelidir.
- Fareyi tartın ve Ketamin / Ksilazin (Ketamin 50 mg / kg, Ksilazin 10 mg / kg) ile intraperitoneal enjeksiyon (IP) kullanarak uyuşturun.
DİKKAT: Vücut ağırlığı 24 g'dan düşük olan fareler ozmotik pompa implantasyon ameliyatı için önerilmez.
- Fare kafasını stereotaktik aparata monte edin ve sabitleyin (Şekil 1B).
- Kafatasını kaplayan dış deriyi kesmek için bir çift cerrahi makas ve kerpeten kullanın. Periferik kafatasını temizlemek için iyot kullanın.
- Ozmotik pompa-beyin füzyon seti implantasyonu için boyun bölgesine yakın bir çift künt başlı kıskaç yardımıyla cildin en dış tabakasını cilt altı deriden ayırın (Şekil 1C).
- Stereotaktik aparatı kullanarak infüzyon noktasını beyin haritasına (Şekil 1D) göre işaretleyin. Bu deneyde iğnenin 3. ventrikül bölgesine implante edilmesi gerekir (Bregma: 0.0 mm lateral, 1.3 mm posterior, 5.7 mm ventral).
- Kafatası üzerinde işaretlenen alanın etrafına tırnak matkabı kullanarak bir delik açın (Şekil 1E).
DİKKAT: Fare beyin zarlarını ve kan damarlarını kırmamaya dikkat edin, böylece beyindeki mikro kan damarlarının bozulmasını önleyin.
- aCSF (kontrol olarak) veya ilaç (Met-CCL5/RANTES protein solüsyonu) içeren mikro-ozmotik pompa-beyin füzyon setini boyun bölgesinin arkasındaki cilt altına yerleştirin ve ilacı fare beynine infüze etmek için beyin infüzyon iğnesini açılan deliğe sokun (Şekil 1E). İğne meninkslere nüfuz edecek ve ventrikülün içine girecektir. Yüzey duyarsızlaştırıcı jel (Şekil 1F) kullanarak iğneyi kafatası üzerindeki yerine sabitleyin ve yapıştırıcı kuruyana kadar 1-2 dakika bekleyin. Ardından, iğnenin üstündeki çıkıntılı parçayı kesin (Şekil 1G-H).
- Kafadaki ameliyat yarasını iyileştirmek için doku yapıştırıcı bir yapıştırıcı kullanın. Yaranın üzerine 50 μL yapıştırıcı sürün, cildin her iki tarafını birlikte çekin ve cildin sızdırmaz hale gelmesi için 30 saniye bekleyin (Şekil 1I).
DİKKAT: Ameliyattan sonra yarayı temizlemek için% 100 alkollü ped ve enfeksiyonu önlemek için streptomisin ile 100 ul penisilin kullanın. not: Fare derisi yara dokusu oluşturacak ve cerrahi yapıştırıcının uygulanmasını takiben birkaç gün içinde iyileşecektir. Tutkalın ana avantajı, cilt tahrişine veya iltihaplanmaya neden olabilecek cerrahi dikişlerden kaçınılmasıdır.
- Fareyi ılık bir tabakta (37 °C'ye kadar ısıtılmış) tutulan temiz bir kafese koyun ve farenin anestezik etkiden kurtulmasını bekleyin.
DİKKAT: Ameliyattan sonra hayatta kalma şansını artırmak için farenin vücut ısısını korumak çok önemlidir.
- Bir haftalık iyileşme döneminden sonra, fareler Oral Glukoz Tolerans Testi (OGTT) ve İnsülin Tolerans Testi (ITT) gibi daha ileri deneyler için hazır olacaktır.
3. Oral Glukoz Tolerans Testi (OGTT)
NOT: Oral glukoz tolerans testini aCSF ve MetCCL5/RANTES (10 ng/mL, 100 μL) infüzyonundan 7 gün sonra gerçekleştirin. Yeterli su kaynağı ile OGTT'den önce fareler için 6 saatlik bir oruç tutun. Hayvanları, işlem sırasında stresi azaltmak için çevreye uyum sağlayabilmeleri için deneylerin yapılacağı aynı çalışma tezgahında tutun.
- Glikoz çözeltisinin hazırlanması: Deneyi yapmadan önce, 3.75 g glikozu 15 mL damıtılmışH2O'daçözerek glikoz çözeltisini hazırlayın.
- Deneysel prosedür sırasında okumaları kaydetmek için bir zaman çizelgesi oluşturun (Tablo 1).
NOT: Deney sırasında doğru kayıt yapılabilmesi için her kan muayenesi arasında uygun aralıklarla bir zaman çizelgesi oluşturmak önemlidir.
- Oruç tuttuktan sonra her fareyi tartın ve enjekte edilecek uygun glikoz miktarını hesaplayın. Örneğin, fare 30 g ağırlığındaysa, uygulanacak glikoz çözeltisi miktarı 300 μL olmalıdır.
- Tezgahta aşağıdaki aletleri hazırlayın:
- Şeker ölçüm cihazı (Pil durumunu kontrol etmek için başlat düğmesine basın; testten önce çalıştığından emin olun.)
- Glikoz çipi
- İnsülin şırıngası (0.3 mL İnsülin şırıngası)
- Tıraş bıçakları
- Zamanlayıcı
- Tezgah kurulduktan sonra, kan şekeri seviyesini aşağıdaki gibi ölçün ve kaydedin: Glükometreye temiz ve yeni bir glikoz çipi koyun ve sıfırlamak için başlat düğmesine basın.
- Fareyi boynunun arkasından alın ve kuyruk bölgesine yeterli kan akışını sağlamak için kuyruğu birkaç kez okşayın.
- Kuyruğun küçük bir parçasını kesmek için yeni bir tıraş bıçağı kullanın ve glikoz çipine küçük bir damla kan (yaklaşık 10-20 μL) sıkın. Doğru ölçüme izin vermek için kan çipi doldurmalıdır. Glükometre glikoz seviyesini hemen gösterecektir. Makine bir "hata" gösteriyorsa, işlemi yeni bir glikoz çipi ile tekrarlayın.
NOT: Glikoz çipi sadece bir damla kan gerektirir. Kan örneğinin birden fazla kez alınması gerektiğinde, kan almak için kuyruğun ucunu doğrudan çipin üzerinde tutarken parmaklarınızı farenin kuyruğu boyunca birkaç kez gezdirerek baskı uygulayın. Kan örnekleri alınırken her seferinde kuyruk ucunu kesmek gerekli değildir.
- Daha sonra, intragastrik gavaj tekniğini kullanarak fareleri oral yoldan glikoz (0.25 g / mL) ile besleyin. Uygulanacak glikoz miktarı aşağıdaki formül kullanılarak hesaplanmalıdır: 10X vücut ağırlığı (BW) μL glikoz çözeltisi (örneğin, fare 30 g ağırlığındaysa, uygulanacak glikoz çözeltisi miktarı 300 μL olacaktır). Oral glikoz uygulandıktan hemen sonra zamanlayıcıyı başlatın.
- Glikoz ölçüm prosedürünü 15, 30, 60, 90 ve 120 dakikada tekrarlayın.
- Tüm glikoz seviyesi okumaları kaydedildikten sonra, tıraş bıçaklarını ve glikoz çiplerini biyolojik tehlike içeren bir kaba atın. Yiyecekleri fare kafeslerine geri koyun ve hayvan odasına geri koyun.
Tablo 1. Oral Glukoz Tolerans Testi (OGTT) kaydı için zaman çizelgesi
| # | Fare Kimliği | beden | glikoz | başlamak | 0 | 15 | 30 | 60 | 90 |
| | ağırlık | μL =10xBW | Saat | Dakika | Dakika | Dakika | Dakika | Dakika |
| 1 | 501 | 25,8 gr | 258 | 9:00 | 9:00 | 9:00 | 9:15 | 9:30 | Saat 10:00 |
| 2 | 502 | 25,3 gr | 253 | 9:07 | 9:07 | 9:07 | 9:22 | 9:37 | 10:07 |
