Bir Fare Modelinde İridokorneal Açı Obstrüksiyonu ile Deneysel Glokom İndüksiyonu

Özet

Kaynak: Bunker, S., et al. Manyetik mikrokürelerin oküler enjeksiyonu ile indüklenen deneysel glokom. J. Vis. Uzm. (2015)

Bu videoda, anestezi uygulanmış bir sıçan, iridokorneal açıyı bloke etmek için manyetik bir alan altında manyetik boncukların ön kamaraya enjekte edildiği oküler bir prosedüre tabi tutulur. Bu tıkanıklık trabeküler ağı tıkar, sulu hümör drenajını engeller ve göz içi basıncının artmasına neden olarak retina ganglion hücrelerine ve optik sinire zarar verir. Bu, glokom benzeri bir durum geliştirir.

Protokol

Hayvan modellerini içeren tüm prosedürler, yerel kurumsal hayvan bakım komitesi ve JoVE veteriner inceleme kurulu tarafından gözden geçirilmiştir.

1. Oküler Hipertansiyon İndüksiyonu

1. Brown Norway sıçanlarının ön kamarasına tek taraflı paramanyetik mikroküre enjeksiyonu yoluyla göz içi basıncını (GİB) yükselterek deneysel glokomu indükleyin. Diğer pigmentli sıçanlar uygun olabilir, ancak kullanıcının önce bunları doğrulaması gerekir.
2. 250-300 g dişi eski damızlık Brown Norway sıçanlarını, yiyecek ve suya erişim ile GİB'deki günlük dalgalanmaları en aza indirmek için sürekli düşük ışıklı bir ortamda (40-60 lüks) barındırın.
3. Sıçan gözünde kullanılmak üzere kalibre edilmiş bir geri tepme tonometresi kullanarak, anestezi ve boncuk enjeksiyonundan önce uyanık hayvanlarda8 temel GİB ölçümleri yapın9. GİB, beş okumanın ortalaması olarak alınır.
4. Sıçanları intraperitoneal olarak verilen 37.5 mg / kg ketamin ve 0.25 mg / kg medetomidin hidroklorür ile anestezize edin. Povidon-iyot uygulamasından (bkz. adım 1.5) ve boncuk enjeksiyonundan (bkz. adım 1.8) önce hayvanın arka ayak reflekslerini test ederek anestezi derinliğini onaylayın. Analjezi için% 0.5 proparakain hidroklorür uygulayın.
   NOT: Hiçbir aşamada göz bebeğini genişletmeyin. Bu, boncukların iridokorneal açıya daha iyi yerleşmesine yardımcı olacak ve lense bağlanmasını önleyecektir. Ameliyat edilmemiş kontralateral gözde kornea kurumasını önlemek için oküler merhem sürün.
5. Ameliyat gözünü enjeksiyondan 5 dakika önce suda %5 povidon-iyot ile yıkayın.
6. 5 dakika sonra, steril gazlı bez kullanarak povidon iyotu fitilleyin ve gözü% 0.9 steril tuzlu su çözeltisi ile yıkayın. Düzenli steril salin uygulaması ile anestezi sırasında gözü nemli tutun.
7. Gözün etrafına toroidal bir mıknatıs yerleştirin.
8. Hank'in Dengeli Tuz Çözeltisinde (HBSS) 30 mg / ml gama ışınlaması ile sterilize edilmiş 8 μm manyetik mikroküreler içeren 25 μl'lik bir çözeltiyi, 33 G eğimli bir iğne kullanarak ön kamaraya enjekte edin.
   1. Boncukları hazırlamak için, yeniden süspanse ederek yıkayın, ardından son 30 mg / ml çözeltiyi yapmadan önce 1 ml HBSS ile 5 dakika boyunca 10.000 x g'da 3 kez santrifüjleyin. Boyunca steril koşulları koruyun.
   2. Enjeksiyon için, iris travması riskini en aza indirmek için iğneyi irise sokmamaya dikkat edin. Bu, iğnenin kornea yüzeyine teğet olacak şekilde, irise mümkün olduğunca paralel olarak yönlendirilmesiyle önlenebilir. Bu aynı zamanda enjeksiyon bölgesinden boncuk kaybını en aza indirmeye yardımcı olacaktır.
      NOT: İbp'yi yükseltmek için kritik olan iridokorneal açı etrafında eşit bir dağılım sağlamak için boncukları hızlı bir şekilde enjekte edin. Ek olarak, boncukları, iğneleri ve manyetik halkaları ayrı ayrı saklayın, böylece boncuklar kümeler oluşturmaz, bu da şırıngaya yüklenmelerini ve enjekte edilmelerini zorlaştırır ve iğne manyetize olmaz.
9. Trabeküler ağdan sulu drenajı engellemek için boncukların iridokorneal açıya yerleşmesini sağlamak için iğneyi enjeksiyondan sonra 1 dakika yerinde bırakın. GİB'deki geçici artışları en aza indirmek için, boncuklar başlangıçta bir miktar su sızıntısına izin vermek için oturduktan sonra iğneyi hafifçe açın. Ameliyatın sonunda, iğnenin ayrı prosedürlerde kullanılmaya devam etmesini sağlamak için iğneyi önce fosfat tamponlu salin (PBS), ardından %70 etanol ve ardından damıtılmış su ile yıkayın. Alternatif olarak, doğru ölçü ve şırınga kombinasyonu mevcutsa tek kullanımlık iğneler kullanılabilir. İsteğe bağlı: iğneler, kullanımlarını uzatmak için bir eğim kaynağı kullanılarak keskinleştirilebilir.
10. Bu aşamada gerekirse, mıknatısı çıkarın ve eksik kapsama alanlarına boncuk çekmek için kullanın.
11. Boncukların iridokorneal açıya iyi bir şekilde yerleşmesini sağlamak için mıknatısı enjeksiyondan sonra 10 dakika daha göz çevresinde bırakın.
12. 0.25 mg / kg atipemezol hidroklorür kullanılarak ters anestezi.
13. Enfeksiyonu önlemek için kloramfenikol veya diğer antibiyotik merhemleri, örneğin gentamisin veya terramisini topikal olarak ve analjezi için% 0.5 proparakain hidroklorür uygulayın. Hayvanları yeniden hareket edene kadar bir ısı matı üzerinde toparlanmaya bırakın, ardından onları ılık bir kutuya aktarın ve iyileşme tamamlanana kadar onlara gıda takviyesi veya nemli düzenli diyet gibi ek besinler sağlayın. Ameliyattan 24 saat sonra ağrı belirtileri gösteren hayvanlara sistemik veya lokal analjezi yapılmalıdır. Tedaviye rağmen bu semptomlar devam ederse, hayvanlar insanca itlaf edilmelidir.
14. Kontralateral gözü ameliyatsız bir kontrol olarak kullanın.
15. Boncuk uygulamasını takiben her 2-3 günde bir ve daha sonra her 2-3 günde bir, sıçan gözünde kullanılmak üzere kalibre edilmiş bir geri tepme tonometresi kullanarak GİB ölçümleri yapın.

Malzemeler

Bu makalede kullanılan malzemelerin listesi

Ad	Şirket	Katalog numarası	Yorumlar
250-300g dişi Kahverengi Norveç eski damızlık sıçanları	Harlan, Birleşik Krallık	203
Tonolab Ribaund Tonometresi	Tiolat	TV02
Ketaset (Ketamin)	Fort Dodge Hayvan sağlığı	BN1000118	37.5 mg/kg
Domitor (medetomidin hidroklorür)	Orion İlaç	140-999	0.25 mg/kg
Povidon iyot	Ekolojik laboratuvar	BN4369LE10	%5
Minim'in Tuzlu Çözeltisi	Bausch ve Lomb	PL00033/5017
Toroidal mıknatıs	Süpermagnet	R-10-07-03-N
Manyetik Mikroküreler	Bangs Laboratuvarları	UMC4N/9692
HBSS	Invitrogen	14025
33 eğimli iğne	Hamilton	7747-01	Özel iğne
Luer uçlu şırınga	Hamilton	80601
Antisedan (atipemezol hidroklorür )	Orion İlaç	141-003	0.25 mg/kg
Kloramfenikol merhem	Medicom	18956-0005