Dopamin Nöronlarını Hedeflemek için Fare Beyin Dokusu Kesitlerinin İmmünohistokimyası

Özet

Kaynak: Kummari, E., et. al., Lazer Yakalama Mikrodiseksiyonu - Bireysel Dopamin Nöronlarının ve Tüm Ventral Tegmental Alanın İzolasyonunun Bir Gösterimi., J. Vis. Uzm. (2015)

Bu videoda, sonraki lazer yakalama mikrodiseksiyonu için beyin dokusu kesitlerindeki dopamin nöronları için immünohistokimya protokolünü gösteriyoruz.

Protokol

Hayvan örneklerini içeren tüm prosedürler, uygun hayvan etik inceleme komitesi tarafından gözden geçirilmiş ve onaylanmıştır.

1. Slaytların ve Dokuların Hazırlanması

1. Silan hazırlık slaytları veya polietilen naftalat (PEN) membran cam slaytları kullanın.
2. RNA izolasyonu için, slaytları RNase dekontaminasyon solüsyonuna batırın, RNaz içermeyen suyla 3 kez yıkayın, ardından kademeli bir dizi RNaz içermeyen etanol ile dehidre edin ve 30 dakika vakumla kurutun.
3. Bir kriyostat kullanarak doku kesitlerini 10 μm kalınlığında kesin ve hazırlanan RNase içermeyen slaytlara monte edin. RNA kalitesini korumak için kesitleme sırasında kesitleri donmuş halde tutun. NOT: LCM, slaytın kenarlarına çok yakın olan dokuyu çıkaramayacağından, dokunun slaytın kenarlarından yaklaşık 4 mm uzakta olduğundan emin olun. Bir PEN membran slaytından doku çıkarmak için, dokunun lamın soldan, üstünden ve altından 4 mm ve lamın sağ tarafından 7 mm olduğundan emin olun, bu da lamın bağlı olmayan membranın boyutlarıdır.
4. Doğrudan immünohistokimya kullanılarak tek tek hücre popülasyonlarının izolasyonu için, dokuyu Silan hazırlık slaytları veya PEN membran slaytları üzerine bölümlere ayırın. Dolaylı immünohistokimya kılavuzlu teknikler kullanılarak doku bölgelerinin izolasyonu için, immünohistokimya için bir Silan hazırlık slaytı üzerine bir set kesit ve LCM için kullanılacak bir PEN membran lamı ve / veya bir Silan hazırlık lamı üzerine alternatif bölümler monte edin.

2. Lazer Yakalama için Doku Hazırlama – İmmünoreaktif Hücrelerin Doğrudan Lazer Yakalaması için Hızlı Tirozin Hidroksilaz İmmünohistokimyası

1. Hidrofobik bir kalemle dokuyu ana hatlarıyla belirtin ve kurumasını bekleyin.
2. Dokuyu aseton-metanol (1:1) çözeltisinde -20 °C'de 10 dakika sabitleyin. NOT: Deneyimlerimiz, aseton-metanol fiksasyonunun tek başına aseton veya metanolden çok daha tutarlı immünohistokimya ile sonuçlandığını göstermiştir.
3. Slaytı fosfat tamponlu salin (PBS) içinde %1 Triton (RNaz içermez) ile durulayın.
4. Bölümleri 100-200 μl PBS ile örtün, tirozin hidroksilaz antikoru ile %1 Triton, 1:100 oranında 400 U/ml RNasin ile seyreltin. 5-10 dakika inkübe edin.
5. PBS'de iki kez ve PBS-1% Triton'da kısa bir süre durulayın.
6. 400 U / ml RNasin ve 50 ng / ml DAPI ile PBS-1% Triton'da 1:100 seyreltilmiş Alexa Fluor 488 ile etiketlenmiş 100-200 μl keçi anti-Tavşan IgG ile dokuyu örtün. 5 dakika inkübe edin.
7. PBS'de 2 kez durulayın, ardından kademeli bir RNaz serbest etanol serisinde (% 75 -% 75 -% 95 -% 95 -% 100 -% 100) 30 saniye kurutun.
8. İki yıkama Ksilende 1 dakika, ardından 5 dakika inkübe edin.
9. } LCM için kullanmadan hemen önce Ksilen'den slaytları çıkarın ve kurumaya bırakın.

Malzemeler

Bu makalede kullanılan malzemelerin listesi

Ad	Şirket	Katalog numarası	Yorumlar
Silan hazırlık slaytları	Sigma-Aldrich, St. Louis, MO	S4651
95% Ethanol-RNase Free	Sigma-Aldrich, St. Louis, MO	E7148
100% Ethanol-RNase Ücretsiz	Sigma-Aldrich, St. Louis, MO	E7023
Rnase Free Triton	Sigma-Aldrich, St. Louis<
Anti-Tirozin hidroksiaz antikoru	EDM Millipore, Billerica, MA	Ab152
Alexa Fluor 488 keçi anti-tavşan IgG	Life Technologies, Grand Island, NY	A-11008
RNaseZap	Life Technologies, Grand Island, NY	AM9780

td style='width:186pt;'>T8787 Serisi