Drosophila fotoreseptör hücrelerinde membran protein kaçakçılığının incelenmesi

Özet

Kaynak: Wagner, K. et al., eGFP Etiketli Proteinler Kullanılarak Drosophila fotoreseptör hücrelerinde membran protein kaçakçılığının incelenmesi. J. Vis. Uzm. (2022).

Bu video, eGFP etiketli TRPL proteinleri kullanılarak Drosophila fotoreseptör hücrelerinde membran protein trafiğinin görselleştirilmesini göstermektedir. Görüntüleme için transgenik sineklerin hazırlanmasını, fotoreseptör hücrelerinin floresan görüntülerinin yakalanmasını ve rabdomerelerde nispi eGFP floresansının ölçülmesiyle TRPL kaçakçılığının nicelleştirilmesini detaylandırır.

Protokol

1. Genel hususlar

1. Protein trafiği ile ilgili analizler için kalıcı olarak rabdomer olarak yerleştirilmiş bir yer değiştiren proteinleri ifade eden Drosophila stoklarını kullanın (örneğin, geçici reseptör potansiyeli benzeri (TRPL) iyon kanalı:: gelişmiş yeşil floresan proteini (eGFP), Arrestin 2 ( Arr2)::eGFP).
2. Deneysel yaklaşım için seçilen sineklerin ışığa maruz kalma koşullarını önceden belirleyin.
   1. Dark adaptasyonu için, sinekleri 25 °C'de istenen süre boyunca karanlık kutularda tutun. Translokasyon deneylerinde 16 saate kadar aydınlatma için (örneğin, sinekleri ifade eden TRPL::eGFP), sinekleri oda sıcaklığında bir floresan tüpün altında tutun.
   2. Sinekleri renkli ışıkla aydınlatmak için, floresan tüple birlikte farklı renkli şeffaf plastik kutular kullanın.

2. Suya daldırma mikroskobu

1. Fly preparation
   1. Şekil 1'de gösterildiği gibi gerekli ekipman ve reaktiflerle çalışma alanını hazırlayın. Önceden belirlenmiş yaş ve aydınlatma koşullarına sahip sinekleri önceden soğutulmuş 15 mL'lik bir santrifüj tüpüne aktarın ve 15 ila 30 dakika boyunca buz üzerinde inkübe ederek uyuşturun.
      NOT: 1 günlük, karanlığa adapte olmuş sinekleri referans olarak yanınızda taşıyın. Genel olarak, karanlığa adapte olmuş sinekler karanlıkta kapaklı bir buzluğa aktarılmalıdır. Işığa adapte olmuş sinekler, oda ışığında buza aktarılabilir.
   2. Buzla uyuşturulmuş bir sineği kafa üstü 200 μL'lik bir pipet ucuna aktarın ve sineği basınçlı hava ile dikkatlice uca doğru itin.
   3. Bir neşter kullanarak pipet ucunu başın hemen önünden kesin. Cımbız kullanarak, sineği uçtan birkaç milimetre uzağa dikkatlice itin. Pipet ucunu tekrar kesin ve pipet ucundan yalnızca sineğin başı dışarı çıkacak şekilde basınçlı hava ile sineği uca doğru geri itin.
   4. Bir nesne slaytına bir parça hamuru yapıştırın ve sineğin sol veya sağ gözü yukarı bakacak şekilde pipet ucunu içine bastırın (Şekil 2A). Görüntü alımından hemen önce, suya daldırma hedefinin alt tarafına büyük bir damla soğutulmuş su yapıştırmak için bir laboratuvar pipeti kullanın (Şekil 2B). En iyi sonuçlar için hemen görüntü alımına geçin.
      NOT: Görüntü alımındaki önemli gecikme, sineğin yeniden uyanmasına ve hareketlerine neden olur ve bu da bulanık görüntülere yol açabilir.
      <
2. span style='background-color:transparent;color:#000000;'>Image acquisition
   1. Hazırlanan sinekle birlikte nesne slaytını dikkatlice mikroskop tablasına yerleştirin ve bir suya daldırma hedefi seçin.
   2. Sineğin gözü damlaya değene kadar suya daldırma hedefini manuel olarak indirin (Şekil 3A, B).
   3. Mikroskop UV lambasını açın ve uygun filtre setini seçin. Sineği objektifin altına yerleştirmek için göz merceklerini kullanın ve mikroskobu gözün yüzeyine odaklayın.
   4. Işık yolunu mikroskop kamerasına doğru kaydırın ve ilgili yazılımda canlı bir görüntü oluşturun. Şekil 3C-E'de daha ayrıntılı olarak gösterildiği gibi, gözün mikroskop objektifine radyal olarak bakması gerektiğini göz önünde bulundurarak kameranın odağını yeniden ayarlayın ve gözün yönünü değerlendirin.
   5. Aşırı doygunluğu (kırmızı piksellerle gösterilir) algılamak için görüntüleme yazılımı içindeki uygun LUT'u (tabloya bak) kullanın.
   6. Pigmentsiz sinekler söz konusu olduğunda, pozlama süresini, en parlak pikseller her görüntü için doygunluk sınırının hemen altında olacak şekilde ayarlayın.
   7. Bir görüntü kaydedin ve kaydın ilgili tüm meta verilerini arşivlemek için ham dosya olarak kaydedin. Aşağıdaki niceleme için görüntüyü .tif bir formatta dışa aktarın.
      NOT: Daha sonraki deneyler için kullanılmak üzere tasarlanmışlarsa, sinekleri görüntü alındıktan hemen sonra kırmızı ışıkla (örn. 630 nm) 5 dakika boyunca aydınlatın. Kırmızı ışık, görüntü alımı sırasında yoğun kısa dalgalı ışıkla aşırı derecede etkinleştirilen fototransdüksiyon kaskadını devre dışı bırakır.
      
3. Suya daldırma mikrograflarının rabdomerelerinde bağıl eGFP floresansının veri analizi ve nicelemesi
   <
   1. span style='background-color:transparent;color:#000000;'>ImageJ/Fiji yazılımını indirin, kurun ve çalıştırın.
   2. Analiz >Et > Ölçümleri Ayarla'ya tıklayarak ImageJ ayarlarını yapın... ve yalnızca Ortalama Gri Değer kutusunu işaretleyin. Dosya'ya tıklayarak .tif bir görüntüyü içe aktarın > Aç... veya sürükleyip bırakarak. Görüntünün odakta olan temsili bir bölgesini seçin ve Ctrl ve + tuşlarına art arda basarak %200-%300 arasında büyütün.
   3. Oval aracını seçin ve Shift tuşuna basarken görüntüde bir floresan rabdomereden önemli ölçüde daha küçük dairesel bir seçim oluşturun. Fare düğmesini bırakmadan önce, ImageJ ana penceresindeki araç çubuğunun altında görüntülenen tam boyutu arayın. Tüm analizler için aynı boyutta dairesel seçim kullanın.
      NOT: Dairesel seçimin piksel veya mikron cinsinden tam boyutu, belirli kuruluma bağlıdır. 1 günlük, karanlığa adapte olmuş kontrol sineklerinin rabdomeral çapının yaklaşık 1/3 veya 1/4'ü kadar bir daire kullanın.
   4. Dairesel seçimi fareyle tıklayıp sürükleyerek veya klavyedeki Ok Tuşlarına basarak taşıyın.
   5. Dairesel seçim içindeki floresan yoğunluklarını ölçmek için daireyi ilk rabdomere (r1) taşıyın ve >Analiz Et > Ölç'e tıklayın veya Ctrl + M kısayolunu kullanın. Ölçülen gri değeri listeleyen bir Sonuç penceresi açılacaktır.
   6. r2-r6 ölçümlerini tekrarlanan ölçümler ve arka plan sinyalinin (b) ölçümü olarak devam edin. Pigmentsiz sinekler söz konusu olduğunda, karşılık gelen hücre gövdesi alanlarının (c1-c6) ek ölçümlerini yapın (Şekil 4).
   7. İki ommatidia daha için 2.3.5 ve 2.3.6 adımlarını tekrarlayın, böylece üç teknik kopya elde edin. Analiz edilen ommatidia'yı Kurşun Kalem aracını kullanarak işaretleyin ve bu görüntüyü dokümantasyon için kaydedin.
   8. Sonuç penceresinden ölçülen gri değerleri seçip kopyalayın ve daha fazla hesaplama için bunları elektronik tablo yazılımına yapıştırın. Floresan yoğunluğu değerlerini kökenlerine göre rabdomere ( r ), hücre gövdesi (c) ve arka plan (b) kategorilerine göre sıralayın. Her kategoriden (Ir, Ic, Ib) ortalama yoğunluğu hesaplayın.
   9. Rabdomere'de bulunan eGFP'nin göreceli miktarını hesaplayın.
   10. Adım 2.3.3'teki sonraki görüntüyle devam edin. Güvenilir bir ölçüm elde etmek için her deney grubundan en az beş bireyden alınan görüntülerin biyolojik kopya olarak kullanılması önerilir.

Sonuçlar

Şekil 1: Suya daldırma mikroskobu çalışma alanı. İhtiyaç duyulan malzemeler: (A) 15 mL santrifüj tüpü, (B) buz taneleri, (C) soğutulmuş damıtılmış su, (D) stereomikroskop, (

Malzemeler

Bu makalede kullanılan malzemelerin listesi

Ad	Şirket	Katalog numarası	Yorumlar
15 mL santrifüj tüpü	Greiner Bio-One	188271
Carbon dioxide anestezisi fly pad	Flystuff	59-172
Soğuk ışık lambası (KL 1500 LCD)	Zeiss
Fiji/ImageJ	NIH
UV lambalı, kameralı, filtre setli ve yazılımlı floresan mikroskobu (AxioImager.Z1m, Axiocam 530 mono, 38 HE, ZEN2 blue edition)	Zeiss
Fluorescent tube	Osram	4050300518039.00
Laboratuvar pipeti (20-200 μL)	Eppendorf
Object slide	Roth	656.1
Pipet uçları (200 μL)	Labsolute	7695844
Hamuru (Blu-Tack)	Bostik	30811745
Stereo mikroskop (SMZ445)	Nikon
UV lambalı stereo mikroskop, kamera, dosyalayıcı seti ve yazılımı (MZ16F, MC170 HD, GFP3, LAS 4.12)	Leica