Hayvan modellerini içeren tüm prosedürler, yerel kurumsal hayvan bakım komitesi ve JoVE veteriner inceleme kurulu tarafından gözden geçirilmiştir.
1. Hayvan Bakımı
- 3-4 aylık erkek C57BL/6J fareleri kullanın. Yatak takımı, yuvalama malzemesi, yiyecek ve su sağlayın ad libitum. Fareleri ortam sıcaklıklarında, sabit 12 saatlik ışık/12 saatlik karanlık döngüleri ile 20 - 22 °C'de kontrol altında tutun.
2. Çarpma Öncesi Hazırlık
- Elektromanyetik stereotaksik darbe cihazına özel yapım silikon kauçuk kaplı metal uç takın. Ucun düz tabanının prob ucunun yüzeyine paralel olduğundan emin olun (Şekil 1A).
- Fareyi %4 izofluran ile uyuşturun ve ardından %2.5 izofluran idame anestezisi uygulayın. Anesteziyi akış ölçer ile kontrol edin. Pedal çekme refleksinin kaybını göstererek hayvan cerrahi anestezi seviyesine ulaşana kadar anestezi seviyesini izleyin.
- Fareyi bir ısıtma yastığı üzerinde yüzüstü konuma getirin. Fareyi anestezi altında tutmak için huni şeklinde bir burun konisi kullanın. Bir düzeltici kullanarak kafayı tamamen tıraş edin. Anestezi altındayken kuruluğu önlemek için farenin gözlerine vazelin oftalmik merhem kullanın.
3. Etki Parametreleri Ayarı
NOT: Darbe sistemi, darbe parametrelerini ayarlamak için bir kontrol kutusu, çarpmayı gerçekleştirmek için bir aktüatör ve 3 hareket eksenli bir dijital stereotaktik çerçeve içerir.
- Darbe cihazının hızını 4 m/sn'ye ve bekleme süresini kontrol kutusunda 240 ms'ye önceden ayarlayın.
4. Çarpma Merkezinin Konumlandırılması
- Vücut ısısını 39 °C'ye yakın tutmak için hayvanın vücudunun altına yumuşak bir ısıtma yastığı koyun. Fareyi, kör uçlu kulak çubuklarıyla yüzüstü pozisyonda stereotaktik bir çerçeveye monte edin.
- Z sürücüsünü hareket ettirerek darbe ucunu farenin kafasına yakın bir yere indirin. X ve Y sürücülerini sagital sütürün üzerindeki hedef koordinatların ortasına hareket ettirerek düz darbe ucunu (9 mm çap) ayarlayın.
- Darbe ucunun bir kenarının, iki kulak arasında çizilen hayali bir yatay çizgiye dikey olarak paralel olduğundan emin olun (Şekil 1C). Etki merkezi, interfrontal ve lambdoid sütürler arasındaki merkezi sagital sütüre karşılık gelir (interaural 9 mm ila interaural 0 mm, lateral 4.5 mm).
5. Darbe Derinliği Ayarı
- Darbe derinliğini doğru bir şekilde ayarlamak için, yalıtımlı silikon kauçuk kaplı darbe ucunu değiştirmek için ek bir prob ucu kullanın.
- Uçları değiştirdikten sonra darbe merkezinde kayma olmadığından emin olmak için, uçları değiştirmeden önce dijital stereotaksik kontrol panelindeki X ve Y kanalını sıfıra ayarlayın.
- X ve Y sürücülerini manuel olarak hareket ettirerek prob ucunu çarpma alanının ortasına getirin.
- Temas sensörünü farenin kuyruğuna klipsleyin.
- Çarpma tertibatını (Z sürücüsü) prob ucu çarpma bölgesinin yüzeyine temas edene kadar aşağı doğru hareket ettirin.
- Stereotaksik kontrol panelindeki Z kanalını sıfıra ayarlayın.
- X ve Y sürücülerini (dijital stereotaksik kontrol panelindeki sıfır düğmelerini DEĞİL) X ve Y sürücüleri sıfır olana kadar (darbe ucunun daha önce konumlandırıldığı yerde) manuel olarak ayarlayarak darbe ucunu çarpma alanına geri taşıyın.
- Kontrol kutusu üzerindeki geri çekme anahtarını hareket ettirerek aktüatörü geri çekin. Çarpma tertibatını (Z sürücüsü) manuel olarak 4 mm aşağı hareket ettirin.
6. Darbe
- Kontrol kutusundaki darbe anahtarına tıklayarak darbeyi tetikleyin ve 4 mm'lik bir deformasyon derinliği elde edin.
7. Çarpma sonrası
- Bir zamanlayıcı kullanarak çarpmadan farenin ilk nefesine kadar geçen süreyi ölçün.
- Hayvanı aletten çıkarın ve vücut ısısını korumak için ılık bir ped üzerine koyun. Sternal yaslanmayı sürdürmek için yeterli bilinci yeniden kazanana kadar hayvanı gözetimsiz bırakmayın.
- Hayvanı temiz bir kafese geri koymadan önce iyileşmesine izin verin. Tamamen iyileşene kadar bir hayvanı diğer hayvanların şirketine iade etmeyin.
- Fareleri günlük olarak gözlemleyin ve tartın. Fareler ağrı belirtileri gösteriyorsa, intraperitoneal olarak her 12-24 saatte bir 1-2 mg / kg'da Meloksikam enjekte edin.
8. Tekrarlayan Çarpma
- Farelere ilk yaralanmadan sonraki 4, 7 ve 10. günlerde (darbeler arasında 72 saatlik aralık) ek yaralanmalar verin.
