Nörodejeneratif Protein Aşırı Ekspresyonu ile Maya Hücrelerinde Histon Modifikasyonlarının Saptanması

Özet

Kaynak: Bennett, S. A., ve diğerleri, Maya Nörodejeneratif Proteinopati Modellerinde Histon Translasyon Sonrası Modifikasyon Değişikliklerinin Karakterize Edilmesi. J. Vis. Uzm. (2019).

Bu video, nörodejeneratif proteinleri aşırı eksprese eden maya hücrelerindeki histon modifikasyonlarını değerlendirme prosedürünü göstermektedir. Adımlar, hücre lizizi, santrifüjleme, elektroforez, membran transferi ve modifiye histonların antikor bazlı tespitini içerir.

Protokol

1. Histon sonrası translasyon değişikliklerini

1. tespit etmek için hücre lizisi ve western blottingCell lysis
   1. Maya hücresi peletlerini buz üzerinde çözün ve hücre peletlerini 100 μL dH₂O'da yeniden süspanse edin.
   2. Hücre süspansiyonuna 300 μL 0.2 M NaOH ve 20 μL 2-merkaptoetanol ekleyin. Yukarı ve aşağı pipetleyerek yeniden askıya alın.
   3. Hücreleri buz üzerinde 10 dakika inkübe edin ve ardından RT'de 30 saniye boyunca bir masa üstü santrifüjde 3.200 x g'da santrifüjleyin.
   4. Hücre peletini 100 μL 1x yükleme boyasında yeniden süspanse edin ve bir ısıtma bloğunda 10 dakika kaynatın.
      NOT: 6x yükleme boyası tarifi Malzeme Tablosunda bulunabilir.
2. Sodyum dodesil sülfat-poliakrilamid jel elektroforezi ve membran transferi
   1. Bir jel tutucuya iki jel yerleştirerek, iç hazneyi çalışan tamponla üste kadar doldurarak ve dış hazneyi iki jel çizgi işaretine kadar doldurarak jel haznesini hazırlayın.
   2. 10 oyuklu %12'lik bir poliakrilamid jele kuyucuk başına 15 μL numune yükleyin. Protein merdiveni şeridi için 5 μL yükleyin.
   3. Jeli 150 V'ta yaklaşık 45 dakika veya yükleme boyası ön kısmı jelin dibine ulaşana kadar çalıştırın.
   4. Jel çalışırken, fiber pedleri (jel başına iki tane) transfer tamponuna (Malzeme Tablosu) batırarak ve poliviniliden florür (PVDF) membranını metanole batırarak membran transferine hazırlanın. Aktarmadan önce zarı transfer tamponunda durulayın.
      NOT: PVDF membranı jelin boyutuna göre kesilmeli ve aktarılan her jel için bir PVDF membranı kullanılmalıdır.
   5. Yarı kuru bir transfer aparatı hücresi üzerine bir transfer 'sandviçi' monte edin: alt elektrottan (1) önceden ıslatılmış bir fiber ped, (2) önceden ıslatılmış ve durulanmış PVDF membran, (3) jel ve (4) ikinci bir önceden ıslatılmış fiber ped yerleştirin.
      NOT: Transfer 'sandviçinde' hava kabarcıklarını önlemek için, kabarcıkları zorlamak için 'sandviçi' serolojik bir pipetle hafifçe yuvarlayın. Jel, PDVF zarının üzerine yerleştirildikten sonra hareket ettirmeyin.
   6. Protein transferini gerçekleştirmek için güç paketini 1 saat boyunca 150 mA'ya ayarlayın (bir 'sandviç' için).
3. Modifikasyona özgü antikorlarla histon sonrası translasyon sonrası modifikasyonların (PTM'ler) tespiti
   1. Membranı transfer aparatından çıkarın. dH₂O ile kısa bir süre durulayın.
      1. İsteğe bağlı olarak, zarı kaplayacak kadar Ponceau-S boyasını küçük bir plastik kutuya dökerek ve RT'de 30−60 saniye hafifçe çalkalanarak Ponceau-S boyası ile protein transferini kontrol edin. Ponceau-S lekesini çıkarın ve arka plan lekesi kaybolana ve protein bantları çıplak gözle görülene kadar dH₂O ile durulayın. Membrandaki tüm lekeler çıkana kadar dH₂O ile durulamaya devam edin.
   2. Küçük bir boyama kutusunda tris tamponlu tuzlu su (TBS) bloke edici tamponda (Malzeme Tablosu) hafifçe sallanarak lekeyi RT'de 1 saat inkübe ederek zarı bloke edin. Lekeyi kapatmak için yeterli engelleme tamponu kullanın.
      NOT: Proteinlerin bulunduğu zar tarafı aşağı bakmayacak şekilde zarı boyama kutusuna dik olarak yerleştirmeye dikkat edin.
   3. 4 °C'de mayaya karşı reaktif histon modifikasyonuna özgü bir antikorla lekeyi gece boyunca boyama kutusunda inkübe edin. Antikoru TBS bloke edici tamponda üretici spesifikasyonlarına göre seyreltin. Ayrıca, modifikasyona özgü antikordan farklı bir konakçı türde yükseltilen anti-toplam H3 gibi uygun bir nükleer yükleme kontrolünü de içerir. Örneğin, tavşanlarda yükseltilmiş bir anti-H3S10ph antikoru ile H3S10ph için problama yapılıyorsa, yükleme kontrolü olarak farelerde yükseltilmiş bir anti-total H3 antikoru kullanın. Bunu her leke için gerektiği kadar tekrarlayın.
      NOT: Antikor dilüsyonları bir ay içinde toplam üç kez yeniden kullanılabilir. 4 °C'de saklayın.
   4. Membranı 4x ev yapımı TBS +% 0.1 polisorbat 20 (TBST) içinde RT'de sallayarak 5 dakika boyunca yıkayın.
   5. RT'de 1 saat boyunca üretici tarafından belirtilen dilüsyonlarda (eşek anti-tavşan 680 ve eşek anti-fare) floresan ikincil antikorlarla lekeyi inkübe edin.
      NOT: Floresan ikincil antikorlar hem saklama hem de kullanım sırasında ışıktan korunmalıdır. Koyu plastik kutularda inkübasyon yapın veya alüminyum folyo ile örtün.
   6. Membranı 4x TBST ile 5 dakika yıkayın ve RT'de sallanırken 5 dakika TBS ile yıkayın.
   7. Floresan Western blot görüntüleme sisteminde lekeyi 2 dakika boyunca görselleştirin. Sırasıyla 800 nm ve 700 nm kanallarında anti-tavşan 680 ve anti-fare 800 ikincil antikorlarını görselleştirin.
      NOT: Çoğaltmalar, bölüm 1'den başlayarak bağımsız olarak yürütülür. Bu deneylerde uygun veri yorumlaması için, antikor sinyal tepkisinin, sinyal yanıtının doğrusal olduğu aralık içinde olduğunu doğrulamak gerekir.

Malzemeler

Bu makalede kullanılan malzemelerin listesi

Ad	Şirket	Katalog numarası	Yorumlar
10x Running Buffer			Karışım: 141.65 g glisin (ThermoFisher BP381-1), 30.3 g Tizma bazı (Sigma-Aldrich T6066), 10 g sodyum dodesil sülfat (Sigma-Aldrich L3771) ve 1 L deiyonize su, pH 8.8.
12% Poliakrilamid Jeller	BIO-RAD	456-1041
2-merkaptoetanol	Sigma-Aldrich	M3148
Anti-asetil-histon H3 (Lys14) Birincil Antikor	MilliporeSigma	07-353 (Lot No. 2762291)	Seyreltme: 1/1000
Anti-asetil-Histon H4 (Lys16) Primer Antikor	Abcam	ab109463 (Lot No. GR187780)	Seyreltme: 1/2000
Anti-asetil-histon H4 (Lys12) Primer Antikor	Abcam	ab46983 (Lot No. GR71882)	Seyreltme: 1/5000
Anti-dimetil-histon H3 (Lys36) Primer Antikor	Abcam	ab9049 (Lot No. GR266894, GR3236147)	Seyreltme: 1/1000
Anti-Histon<	ab24834 (Lot No. GR236539, GR174196, GR3194335)	Nükleer Yükleme Kontrolü; Seyreltme: 1/2000
Anti-fosfo-histon H2B (Thr129) Primer Antikor	Abcam	ab188292 (Lot No. GR211874)	Seyreltme: 1/1000
Anti-fosfo-histon H3 (Ser10) Primer Antikor	Abcam	ab5176 (Lot No. GR264582, GR192662, GR3217296)	Seyreltme: 1/1000
BioPhotometer D30<	6133000010
Centrifuge 5804/5804 R/5810/5810 R	Eppendorf	22625501
Donkey Anti-Mouse IRDye 800 CW	LI-COR	926-32212 (Lot No. C60301-05, C61116-02, C80108-05)	Seyreltme: 1/5000
Donkey Anti-Rabbit IRDye 860 RD	LI-COR	926-68073 (Lot No. C60217-06, C70323-06, C70601-05, C80116-07)	Seyreltme: 1/2500
Ethanol	Sigma-Aldrich	E7023
Ekstra kalın leke kağıdı (filtre kağıdı)	BIO-RAD	1703968
Immobilon-FL Transfer Membranları	MilliporeSigma<
Loading Dye			Mix: 1.2 g sodyum dodesil sülfat, 6 mg bromofenol mavisi (Sigma-Aldrich B8026), 4.7 mL gliserol, 1.2 mL 0.5M Trizma baz pH 6.8, 0.93 g DL-Dithiothreitol ( Sigma-Aldrich D0632) ve 2.1 mL deiyonize su.
Methanol	ThermoFisher	A412-4
Mini-PROTEAN Tetra Vertical Electrophoeresis Cell	BIO-RAD	1658004<
Çok kanallı pipet	Eppendorf	2231300045
Nuclease Free Water	Qiagen	129114
Odyssey Fc Imaging System	LI-COR Biosciences	2800-03
pAG303GAL-a-synuclein-GFP	A. Gitler'den Gift
pAG303GAL-ccdB	Addgene	14133
pAG303Gal-FUS	Addgene	29614
pAG303GAL-TDP-43	A. Gitler'den Gift	<
Poli(etilen glikol) (PEG)	Sigma-Aldrich	P4338	%50 w/v solüsyon hazırlayın.
Ponceau S Stain	Sigma-Aldrich	P3504	Mix: 0.5 g %0.1 w/w Ponceau S boya, 5 mL %1 v/v asetik asit (Sigma-Aldrich 320099) ve 500 mL deiyonize su.
PowerPac Basic Power Supply	BIO-RAD	164-5050
Sodyum dodesil sülfat Yükleme Tamponu			-20 oC'de saklayın. 6X, Karışım: 1.2 g sodyum dodesil sülfat, 6 mg bromofenol mavisi, 0.93 g DL-Dithiothreitol, 2.1 mL deiyonize su, 4.7 mL gliserol ve 1.2 mL 0.5 M Trizma bazı, pH 6.8.
Sodyum hidroksit	Sigma-Aldrich	221465	0.2 M çözelti hazırlayın.
TBS + %0.1 Tween 20 (TBST)			Mix: 100 mL 10X TBS, 1 mL Tween 20 (Sigma-Aldrich P7949) ve 900 mL deiyonize su.
TBS Engelleme Tamponu	LI-COR	927-5000
Trans-Blot SD Yarı Kuru Elektroforetik Transfer Hücresi	BIO-RAD	170-3940
Transfer Buffer			Mix: 22,5 g glisin, 4,84 g Tizma bazı, 400 mL metanol, 1 g sodyum dodesil sülfat ve 1,6 L deiyonize su.
Tris-Buffered Saline (TBS)			10X, 7.6 pH, Çözüm: 24 g Trizma bazı ve 88 g sodyum klorür (Sigma-Aldrich S7653) karıştırın. Deiyonize su ile 1 L'ye kadar doldurun.
WT 303 S. cerevisiae yeast	J. Shorter'dan Gift

td style='width:108pt;'>Abcamtd style='width:108pt;'>Eppendorftd style='width:108pt;'>IPFL00010td style='width:314pt;'> td style='width:314pt;'>