$$\rightleftharpoonup{xx}$$
$$\longleftharp{xx}$$,
$$\longrightharp{xx}$$,
1. Tek tip boyutta tümör sferoidlerinin oluşturulması
NOT: Kök benzeri hücreler, B27 takviyesi, heparin, Fibroblast büyüme faktörü 2 (FGF-2), penisilin ve streptomisin ile tamamlanan nörobazal ortamda kültürlenir. Bu hücreler kültürde kendiliğinden sferoidler oluşturur.
- Tümör hücrelerini 5 mL fosfat tamponlu salin (PBS) ile yıkayın ve hücreleri 0.5-1 mL ayrışma enzimi ile 37 ° C'de 5 dakika inkübe edin.
- 4-4.5 mL PBS ile yıkayın ve 10 mL tam büyüme ortamı ekleyin (tam nörobazal ortam, cNBM).
- Tripan mavisi ve hücre sayma odası slaytı ile otomatik sayma tekniği kullanarak hücreleri sayın.
- Sferoid başına 104 hücreli 100 sferoid oluşturmak için (tercih edilen boyuta göre), 8 mL NBM'de 106 hücreyi 2 mL %2 metilselüloz ile karıştırın.
- Süspansiyonu steril bir sistem kabına aktarın ve çok kanallı bir pipetle 100 μL/kuyuyu 96 kuyulu yuvarlak bir alt plakaya dağıtın.
- Plakayı 37 °C, %5 CO2 ve %95 nemde inkübe edin. Eşit büyüklükte sferoidler oluşacak ve 3-4 gün sonra kullanılabilecektir.
2. Üç boyutlu deneyler
- İstila
- Hazırlık
- 1x PBS, 0.023xV kollajen, 1 M sodyum hidroksit ve steril H2O. Çözeltiyi buz üzerinde 30 dakika inkübe edin.
- {{}} 500 μL'lik tüplerde yuvarlak alt kuyu plakasından sferoidleri toplayın ve 2x'i 200 μL 1x PBS ile yıkayın.
- Sferoidleri dikkatlice 100 μL kollajen matrisine pipetleyin ve normal 96 oyuklu plakalarda bir kuyunun ortasına yerleştirin.
- Kollajen jeli 37 ° C'de 30 dakika inkübe edin ve ardından jelin üzerine cNBM ekleyin. İnhibitörler veya aktivatörler (örneğin, Şekil 1B, 1C'de gösterildiği gibi hidrojen klorür) bu adımda ortama eklenebilir.
- Görüntü toplama ve analizi
- Kollajen eklendikten 24 saat sonra parlak alan modunda bir video mikroskobu ile sırayla fotoğraf çekin.
- Resimleri manuel veya yarı otomatik bir şekilde analiz etmek için Fiji'yi kullanın. Bunu manuel olarak yapmak için, serbest el seçim aracıyla çekirdeğin ve sferoidin toplam alanının etrafını çizin ve her bir sferoidin invaziv alanını, çekirdek alanı ile toplam alanı çıkararak ölçün. Görüntüleri yarı otomatik bir şekilde analiz etmek için, istilacı alanı belirlemek için bir makro kullanın.
