ELISA Kullanarak Nörodejeneratif Hastalıkla İlişkili Protein α-Sinükleinin Saptanması

Özet

Kaynak: Bétemps, D., et al., İnsan A53T Mutasyona Uğramış α-sinükleini Aşırı İfade Eden Transgenik Farelerin Beyninde Gelişmiş ELISA ile Hastalıkla İlişkili α-sinükleinin Tespiti. J. Vis. Uzm. (2015).

Bu video, ELISA kullanılarak transgenik farelerden alınan beyin dokusunda nörodejeneratif hastalıkla ilişkili protein α-sinükleini tespit etme prosedürünü göstermektedir. Adımlar, hastalıkla ilişkili formlarını ölçmek için doku homojenizasyonu, santrifüjleme ve α-sinüklein proteininin ELISA tespitini içerir.

Protokol

Hayvan örneklerini içeren tüm prosedürler, uygun hayvan etik inceleme komitesi tarafından gözden geçirilmiş ve onaylanmıştır.

1. Diseke Beyin Bölgelerinden α-Sinüklein (αS) Ekstraksiyonu

1. Hipokampusun diseke edilmesi dışında uçları bir arada tutulan iki forcip kullanarak düşük güçlü bir büyüteç (8X büyütme) ile buz üzerinde 35 mm'lik plastik bir petri kabında tüm bir beyni inceleyin. Beyin bütünlüğünü korumak için 10 dakikayı aşmayın. Beynin sağ tarafını yukarı yerleştirin ve aşağıdaki beyin bölgelerini şu sırayla alın:
   1. İki koku ampulünden birini, hemen arkasına yerleştirilmiş forseps kullanarak ayırın. Aşağı doğru hareket ettirerek beyinden ayırın. İkinci ampul için bu işlemi tekrarlayın.
   2. Forteksleri iki korteks arasına nazikçe sıkıştırın ve iki korteksin ayrışmasını kolaylaştırmak için ileri doğru hareket ettirin. Beyni bir forseps ile yerinde tutarak, korteksi hipokampustan ayırmak için başka bir tane kullanın.
   3. Forsepsleri korteksin 2 mm altına yerleştirin. Hipokampusun üst kısmı görünene kadar forseps üzerinde hafif bir baskı uygulayın. Korteksin ilk kısmını soyun ve ikinci kısımla tekrarlayın. Hipokampustan başlayıp beynin ön tarafına doğru ilerleyen iki korteksi ayırmak için forseps kullanın.
   4. Açık forsepsleri hipokampuslardan birinin etrafına yerleştirin. Hipokampusun altındaki forsepsleri kapatın, ardından mümkün olduğunca geri kazanarak yavaşça çıkarın. İkinci hipokampus için prosedürü tekrarlayın.
   5. Açık forsepsleri striatalardan birinin altına yerleştirin ve nazikçe beyinden ayırın. Striatumdan kalan korteksi çıkarmak için forseps kullanın. İkinci striatum için bu işlemi tekrarlayın.
   6. Beyinden ayrılmasını kolaylaştırmak için beyinciğin konturunu 2 mm hafifçe bastırmak için forsepsleri kullanın. Forsepsleri beyinciğin hemen arkasına yerleştirin ve forsepsleri ileri doğru hareket ettirerek çıkarın.
   7. Beyin sapıyla nerede birleştiğini net bir şekilde görmek için mezensefalonu kaldırmak için forsepsin geniş kısmını kullanın. Kavşakta dikey bir kesi yapın, ardından beyin sapını çıkarın.
   8. Forsepsleri dört yuvarlak yapıdan oluşan mezensefalonun arkasına yerleştirin. Mezensefalon kalan beyinden tamamen ayrılana kadar dikey olarak kesin.
2. Mevcut doku sayısına bağlı olarak yüksek tuz (HS) tamponunda değişken yüzdeli (ağırlık/hacim) homojenatlar hazırlayın: 10 ila 30 mg arasındaki bir ağırlık için %5, 30 ila 80 mg arasındaki bir ağırlık için %10 ve 80 mg'ın üzerindeki bir ağırlık için %20.
   1. }Beklenen homojenat yüzdesini elde etmek için diseke edilen beyin bölgelerine yeterli miktarda HS tamponu ekleyin.
   2. Girdap yapın ve dokuların HS tamponuna tamamen daldırıldığını kontrol edin.
   3. Diseke beyin bölgelerinden veya servikal omurilikten hazırlanan örnekleri, bir borosilikat cam tüp ve A ve B olmak üzere iki havaneliden oluşan bir doku öğütücü ile homojenize edin.
   4. Kırılacak her beyin bölgesini doğrudan tüpe dökün. Havaneli A'yı tüpe yerleştirin ve geri çekin. Dokuyu ayırmak için bu hareketi yaklaşık on kez tekrarlayın. Ardından, dokuyu 20 hareketle öğütmeye devam etmek için havaneli B kullanın. Homojenatları 1 ml'lik bir transfer pipeti ile 1,5 ml'lik bir tüpe aktarın.
3. Topraklanmamış beyin parçalarını ortadan kaldırmak için numuneleri 1.000 x g'da 5 ° C'de 4 dakika santrifüjleyin. Süpernatantları alın, 200 μl'lik alikotlara bölün ve sonraki analizler için -80 ° C'de tutun.

1. αS'nin ELISA ile saptanması

1. Kaplama antikorlarını 0.01 ng/ml'ye seyreltin. 50 mM Na₂CO₃/NaHCO₃ tamponunda (pH 9.6) antikor antikoru kullanın.
2. 96 oyuklu mikroplakaları bu kaplama çözeltisinin oyuğu başına 100 μl ile kaplayın ve 4 °C O/N'de bırakın. Tespit antikorları syn514, klon 42, LB509, AS11, 4D6 veya 8A5 kullanarak ELISA'lar için kaplama çözeltisinde anti-αS tavşan poliklonal antikorunu kullanın. Anti-αS monoklonal antikor klonu 42'yi, anti-pSer129 αS tespit antikoru ile kombinasyon halinde bir kaplama çözeltisi olarak kullanın.
   NOT: Gerekirse, ELISA yapılmadan önce plakalar bir hafta boyunca 4 °C'de tutulabilir.
3. Plakaları oyuk başına% 0.05 Tween 20 (PBST) ile 300 μl fosfat tamponlu tuzlu su ile beş kez yıkamak için bir plaka yıkayıcı kullanın. Bu adımdan itibaren inkübasyon RT'dedir.
4. Kuyucuk başına 200 μl T20 PBS (fosfat tamponlu tuzlu su) bloke edici tampon ekleyin. 150 rpm'de 1 saat çalkalayın. Plakaları PBST ile beş kez yıkayın.
5. Beyin homojenatlarını seyreltin (%20 homojenatların 1:100'ü, PBST BSA %1'de %10 homojenatların 1:50'si ve %5 homojenatların 1:25'i seyreltin) ve her bir oyuğa 100 μl ekleyin. Daha sonra 150 rpm'de çalkalarken 2 saat inkübe edin. Plakaları PBST ile beş kez yıkayın.
6. PBST'deki farklı αS tespit antikorlarını, Materyal Listesinde belirtilen seyreltmelerde sığır serum albümini (BSA)% 1 ile ekleyin. 150 rpm'de 1 saat inkübe edin. Plakaları PBST ile beş kez yıkayın.
7. 150 rpm'de çalkalarken 1 saat boyunca BSA% 1 ile desteklenmiş PBST'de 1: 8.000 seyreltilmiş fare önleyici veya tavşan önleyici IgG HRP konjugatları ekleyin. Plakaları PBST ile beş kez yıkayın.
8. Her oyuğa 100 μl 3,3 ', 5,5'-tetrametilbenzidin (TMB) çözeltisi ekleyin ve 150 rpm'de çalkalarken karanlıkta 15 dakika inkübe edin.
9. Kuyucuk başına 100 μl 1 N HCl ekleyerek reaksiyonu durdurun, ardından mikroplaka okuyucu ile 450 nm'de absorbansı ölçün.
10. Veri analizi için, analiz edilen örneklerin her biri için ölçülen OD değerlerinden, herhangi bir fare beyni örneği (boş kuyu) dışındaki tüm reaktiflerle bir kuyuda elde edilen OD değerini çıkarın.

Malzemeler

Bu makalede kullanılan malzemelerin listesi

Ad	Şirket	Katalog numarası	Yorumlar
LB509		Abcam	ab27766	Detection antikoru 1/2000
AS11		Anses<	Detection antikoru 1/1000
4D6		Abcam	ab1903	Detection antikoru 1/2000
PSer129		Abcam	ab59264	Detection antikoru 1/3000
PSer129 EP1536Y		Abcam	ab51253	Detection antikoru 1/1000
Syn514		Abcam	ab24717	Detection anticouple 1/500
Clone 42		BD Biosciences	610787	Kaplama ve algılama antikoru (1/2000)
8A5		Dr. Anderson tarafından sağlanmıştır		Detection anticouple 1/2000
Poliklonal anti-alfa syn antikor		Millipore	AB5038P	Kaplama antikoru
Anti-fare IgG HRP eşleniği		Southern Biotech	1010-05
Anti-tavşan IgG HRP konjugat		Southern Biotech	4010-05
Keçi anti-fare IgG HRP konjugat		Dianova	115-035-164
HS buffer	Tris-HCl 50 mM	Euromedex	26-128-3094-B	pH 7.5'te ayarlayın ve 4°C'de
NaCl 750 mM	Euromedex	1112-A
EDTA 5 mM	Euromedex	EU0007-B
DTT 1 mM	;'>43815
PBS	Disodyum hidrojen fosfat1 mM	Euromedex	1309	pH 7.5
Monopotasyum fosfat 1.5 mM	Euromedex	2018
NaCl 137 mM	Euromedex	1112-A
KCl 2.7 mM	Euromedex	P017
Tween 20		Euromedex	2001-C
BSA		Sigma	A7906
Microplate MaxiSorpTM		Thermo Scientific	442404
Tampon karbonat 50 mM pH 9.6<	Sigma	71360	2,86 g/L
Sodyum bikarbonat	Merk	6329	3,36 g/L, pH9,6
Superblock T20 PBS engelleme tamponu		Pierce	E6423H<
TMB		Sigma	T0440	ELISA için kullanılır<
	Analytik Jena AG	847-0104200302	Epitop eşleme
HCl 1N		Chimie plus	40030
Ribolyser		Thermo	Hızlı hazırlık FP120	Bu adımda
Grinding tubes		Biorad	355-1197
Plate washer		Tecan	Columbus Pro<
Plate reader		Biorad	Model 680
Düşük güçlü büyüteç		VWR	630-1062	X8 büyütme
Forceps Dumont#7		WPI	14097	Diseksiyon adımları
Transfer pipeti 1ml Samso		Samso	43231
1.5 ml tubes		Dutscher	33290

td style='width:200pt;'> tutuntd style='width::' 200pt;'>Sodyum karbonat dekahidrattd style='width:200pt;'>10 X concentratedtd style='height:15.75pt;width:200pt;'>TMB için kullanılır buz üzerinde devam edintd style='width:200pt;'> için