Kanser Hücrelerinin İnternal Karotis Arter Enjeksiyonu ile Beyin Tümörü Metastazının Modellenmesi

Özet

Kaynak: Lim, M., et al. Kanser hücrelerinin iç karotis arter enjeksiyonu ile beyin metastazının modellenmesi. J. Vis. Uzm. (2022)

Bu videoda, anestezi uygulanmış bir fare, beyne hedeflenen iletimi kolaylaştırmak için kanser hücrelerinin ortak karotis artere (CCA) enjekte edildiği cerrahi bir prosedürden geçiyor. Prosedür, enjekte edilen hücreleri iç karotis artere (ICA) yönlendirmek için karotis arterlerin hassas bir şekilde dikilmesini ve manipüle edilmesini içerir ve zamanla beyinde tümör oluşumunu teşvik eder.

Protokol

Hayvan modellerini içeren tüm prosedürler, yerel kurumsal hayvan bakım komitesi ve JoVE veteriner inceleme kurulu tarafından gözden geçirilmiştir.

1. Kanser hücrelerinin enjeksiyona hazırlanması

NOT: Bu çalışmada, insan meme kanseri hücre hattı BT-474 (BT474) kullanılmıştır. BT474, %10 fetal sığır serumu ve %1 insülin ile desteklenmiş RPMI (Roswell Park Memorial Institute Medium) 1640 besiyerini içeren tam bir büyüme ortamında kültürlendi. Hücreler, hava atmosferinde% 5 karbondioksit ile 37 ° C'de bir inkübatörde tutuldu. Uydu tandem tekrar testi ile hücre hattını doğrulayın, varsa raportör proteinin (örneğin, lusiferaz) ekspresyonunu doğrulayın ve mikoplazma enfeksiyonu olup olmadığını kontrol edin.

1. BT474 kanser hücrelerini, enjeksiyondan önce% 70 -% 80 birleşmeye kadar 10 mL tam büyüme ortamı ve kültürü (% 5 karbon dioksit ile% 37 ° C'de) kullanarak bir T75 şişesine 2.0 × 10^6 hücre tohumlama yoğunluğunda tohumlayın.
2. Enjeksiyon gününde, büyüme ortamını atın ve hücre tek tabakasını fosfat tamponlu salin (PBS) ile iki kez yıkayın.
3. 5 mL önceden ısıtılmış hücre kültürü ayrışma reaktifi ekleyin ve 37 ° C'de 5 dakika veya hücreler ayrılana kadar inkübe edin. 5 dakika sonra, hücre ayrılmasına yardımcı olmak için şişeye hafifçe vurun.
4. Ayrışma reaktif aktivitesini söndürmek için% 10 fetal sığır serumu içeren 5 mL tam büyüme ortamı ekleyin.
5. Hücre kümelerini azaltmak için pipetleme yaparak hücreleri nazikçe yeniden süspanse edin.
6. Hücre süspansiyonunu 50 mL'lik bir tüpe aktarın ve oda sıcaklığında 3 dakika boyunca 180 x {{TAG_63 TAG_64}} derecede santrifüjleyin.
7. Süpernatanı boşaltın ve hücre topaklanmasını en aza indirmek için hücre topaklanmasını en aza indirmek için kalsiyum ve magnezyum içermeyen 10 mL Hank'in Dengeli Tuz Çözeltisi (HBSS) içinde hücre peletini yeniden süspanse edin.
8. Hücre süspansiyonunu oda sıcaklığında 180 x g{{TAG_83 TAG_84}} 3 dakika boyunca santrifüjleyin.
9. Artık serum/ayrışma reaktifini çıkarmak için süpernatanı boşaltın ve hücre peletini 3 mL HBSS'de yeniden süspanse edin.
10. 50 mL'lik yeni bir konik tüpe 100 μm'lik bir hücre süzgeci yerleştirin ve hücre kümelerini çıkarmak için hücre süspansiyonunu geçirin.
    NOT: Kan damarı tıkanıklığını ve enjeksiyonda inme riskini en aza indirmek için tek hücreli bir süspansiyon gereklidir.
11. Tripan Blue dışlaması ve standart yöntemler kullanarak bir hemositometre kullanarak canlı hücrelerin sayısını hesaplayın.
12. Hücre süspansiyonunu HBSS ile 2.5 x 10⁶ hücre/mL'lik bir hücre konsantrasyonuna seyreltin.
13. Tüpü buz üzerinde yatay tutun ve topaklanmayı en aza indirmek için tüpü periyodik olarak hafifçe sallayın. Hücre süspansiyonu buz üzerinde en fazla 6 saat saklanabilir.
    NOT: Sallanma manuel olarak yapıldı, ancak bu aynı zamanda düşük devirde bir çalkalayıcı kullanılarak da yapılabilir.

2. Farenin işlem için hazırlanması

NOT: Bu çalışmada 4-5 haftalık dişi NOD scid fareler kullanıldı. İşlemden sonra beslenmeyi teşvik etmek için işlemden 3 gün önce farelere yumuşak diyet toparlanma gıdası (örneğin, diyet jeli, hidrojel, püre haline getirilmiş fare yemeği) verin.

1. Otoklav cerrahi aletleri. Cerrahi alanı ve ekipmanı yüzey dezenfektanı ile püskürtün ve silin, ardından %70 etanol ile silin.
2. Hipotermiyi önlemek için cerrahi tahtanın altına bir hayvan ısı matı yerleştirin. Ameliyattan 30 dakika önce bunu açın. Cerrahi tahtayı yüzey dezenfektanı ile püskürtün ve silin, ardından %70 etanol ile silin.
3. Kurtarma için temiz bir hayvan barınağı kafesi ve ılık bir ısıtma yastığı hazırlayın.
4. Temiz kişisel koruyucu ekipman (önlük, maske, saç filesi ve eldiven) giyin. Temiz muayene eldivenleri ve 'yalnızca alet ipuçları' tekniği kullanarak prosedür boyunca steriliteyi koruyun.
5. Fare pedal refleksini kaybedene kadar 2 L / dk oksijen akışı ile% 5 izofluran kullanarak fareyi bir anestezik oda ile uyuşturun.
6. Hayvanı odadan çıkarın ve kalan cerrahi prosedür için 2 L / dk'lık bir oksijen akışında% 2 izofluran sağlayan bir burun konisine yerleştirin.
7. Tanımlama için kulak yumruk faresi ve boyun bölgesinden kürkü tıraş etmek için elektrikli makas kullanın. Açıkta kalan ciltteki fazla tüyleri bant kullanarak temizleyin.
8. Gerekli anestezik ve analjezik ilaç dozlarını hesaplamak için fareyi tartın. Buprenorfin ve meloksikamı sırasıyla 50 μg/kg ve 1 mg/kg'da deri altı enjeksiyon yoluyla uygulayın.
9. Fareyi sıcak bir cerrahi tahtaya aktarın ve burun konisini bantla sabitleyin.
10. Kurumayı önlemek için gözlere oküler kayganlaştırıcı sürün.
11. Önce cerrahi panele bantlanmış iplik kullanarak üst kesici dişleri asarak, ardından ön ve arka bacakları bantlayarak fareyi nazikçe sabitleyin. Bu adım vücudu uzatır ve işlem sırasında boynu düz tutar.
12. Ameliyat öncesi cilt hazırlığını aşağıda anlatıldığı gibi gerçekleştirin.
    1. Cilt mikroflora yükünü azaltmak ve gevşek tüyleri gidermek için boynu topikal bir antiseptik (povidon-iyot) ile silin. Kesi yerinin yeniden kirlenmesini önlemek için cildin merkezinden dışa doğru çalışarak temizleyin. İşlemi %70 etanol kullanarak tekrarlayın. Dezenfeksiyon için üç alternatif tur iyot ve etanol gerçekleştirin.
    2. Hayvanın üzerine cerrahi bir örtü serin. Bu, bir parça steril kağıt havlu veya otoklav torbasından kesilir ve şekillendirilir.
13. Cerrahi aletler için steril kağıt havlu veya otoklav torbaları yerleştirin.
14. İşleme devam etmeden önce yeterli anesteziyi sağlamak için via 'Çimdikleme testi' refleksini kontrol edin.

3. İnternal karotis enjeksiyonu

NOT: Bu deneyde, enjeksiyon prosedürünü kolaylaştırmak için 31 G'lik bir infüzyon kanülü ve ayakla aktive edilen şırınga sürücü kurulumu kullanıldı. Bu kurulum isteğe bağlıdır ve kullanıcı 31 G'lik bir insülin şırıngası kullanabilir ve 3.11 ve 3.12 adımlarını atlayabilir. İnfüzyon kanülünü hazırlamak için, iki çift dikiş kelepçesi kullanarak iğne kısmını 31 G'lik bir iğnenin şırınga bağlantı kısmından çekin ve ayırın. Daha sonra, iğne kısmını yaklaşık 10 cm uzunluğunda ince bir infüzyon borusunun bir ucuna takın.

1. Diseksiyon mikroskobunu farenin üzerine yerleştirin.
2. Makas kullanarak, çenenin 5 mm altından başlayarak göğüs girişine kadar boyun bölgesinde orta hat boyunca 15 mm'lik dikey bir kesi yapın.
3. İki çift açılı forseps kullanarak, cildi ve alttaki tükürük bezlerini ayırın ve trakeayı açıkta tutmak için ekartörler uygulayın. Bir sonraki adım, trakeaya paralel uzanan karotis kılıfını ortaya çıkaracaktır.
4. İki çift ince açılı forseps kullanarak, sağ karotis kılıfını ortaya çıkarmak için trakeaya bitişik kas ve yağ dokusunu kör bir şekilde inceleyin. Karotis kılıfı, ana karotis arter, ven ve vagus sinirini kaplayan fibröz tabakadır ve bu demet, parlak kırmızı ana karotis arter tarafından görüntülenebilir. Bu çalışmada enjeksiyon sağ karotis artere yapıldı.
5. Ortak karotis arter kaudalinin bir segmentini, çevredeki fasyanın karotis çatallanmasına kadar temizleyin ve onu vagus siniri ve damarlardan ayırın.
6. Karotis bifurkasyonunu (dış ve iç karotis arterleri birleştiren kavşak) çevredeki sinirlerden ve fasyadan izole edin ve temizleyin. İnce forsepsleri dış karotis arterin altına yerleştirin ve arterin altına ipek bir dikiş (5-0 kalınlığında) geçirin. Düğümü ve dikişi sıkın ve fazla çizgiyi kesin.
   NOT: Bu bağ (L1), enjeksiyonun dış karotis arterden geçmesini önleyecektir.
7. İnce forsepsleri ortak karotis arterin altına yerleştirin ve arterin altına ipek bir dikiş (5-0 kalınlığında) geçirin. Bir düğüm bağlayın ve dikişi önerilen enjeksiyon bölgesine yakın bir konumda sıkın. Fazla dikişi yaklaşık 10 mm çizgi bırakarak kesin.
   NOT: Bu ikinci bağ (L2) enjeksiyondan sonra kan akışını ve kanamayı kısıtlayacaktır. Enjeksiyon sırasında karotis arteri konumlandırmak ve tutmak için de kullanılır.
8. Yaklaşık 10 mm x 5 mm boyutlarında (otoklavlanmış) düşük tiftikli tek kullanımlık sileceklerden oluşan bir şeridi kesin ve nemlendirin. Şeridi 4 mm x 5 mm, 2-3 mm kalınlığında katlayın ve önerilen enjeksiyon bölgesinde karotis arterin altına yerleştirin. Bu, enjeksiyon sırasında damarı destekleyecektir.
9. Önerilen enjeksiyon bölgesine ortak karotis arter rostral üzerine, gevşek bir düğüm ile üçüncü bir ligasyon (L3) yerleştirin. Bu sadece enjeksiyondan sonra sıkılır (adım 3.16'da).
10. Hücre süspansiyonunu nazikçe çalkalayın ve 200 μL hücre süspansiyonunu bir insülin şırıngasına (31 G'lik bir iğne ile) çekin.
11. Şırıngayı, aktif bir ayak pedalına bağlı olan şırınga sürücüsüne yükleyin.
12. Şırıngaya 31 G iğneli ince bir kanül takın ve çizgiyi astarlayın.
13. Karotis arterin iyi konumlandırılıp konumlandırılmadığını ve basınçlı olup olmadığını kontrol edin.
14. Biri birinci bağın ucuna hafifçe gerdirilen ve diğeri 31 G iğneyi tutan iki ince açılı forseps kullanarak, iğneyi delinmemesine dikkat ederek kan damarının lümenine eğimle yavaşça sokun.
15. 100 μL hücre süspansiyonunu (adım 1.13'ten itibaren) 10 μL / s'de ortak karotis artere yavaşça enjekte edin. Bu, kan damarına 2,5 × 10^5 hücre verecektir. Başarılı enjeksiyon, karotis kan damarından kanın temizlenmesi ile görselleştirilir.
16. Geri akışı ve kanamayı önlemek için iğneyi çektikten hemen sonra gevşek bağı (L3) (adım 3.9'dan itibaren) nazikçe kaldırın ve sıkın. Fazla sütürü kesin.
    NOT: İğnenin çekilmesinden sonra az miktarda kan fışkırması görülmesi normaldir. Ancak üçüncü bağ sıkılaştırıldıktan sonra herhangi bir aktif kanama olmamalıdır.
17. Nemli, düşük tiftikli tek kullanımlık silecekleri çıkarın.
18. Bir P200 pipeti kullanarak, cerrahi boşluğu 150-200 μL steril su veya tuzlu su ile iki kez durulayın.
19. Kanama olup olmadığını tekrar kontrol edin ve ardından ekartörleri çıkarın.
20. Yumuşak dokuyu, tükürük bezlerini ve cildi karotis arter ve trakea üzerinde yeniden konumlandırın.
21. Kesiğin cilt tabakasını bir dikiş iğnesi tutucusu, forseps ve sürekli bir düzende emilebilir veya emilmeyen 6/0 monofilament sütür kullanarak kapatın.
22. Kanül iğneli şırıngayı atın ve bir sonraki fare için yeni bir kurulum hazırlayın. Yeni bir şırınga kullanmak, her fareye enjekte edilen hücre sayısının tutarlı olmasını sağlayacaktır.
    NOT: Prosedürün temsili anlık görüntüleri Damar, enjeksiyon sızıntısı veya kanama ile gösterilen iğne tarafından delinir veya yırtılırsa, prosedür başarısız sayılır. Bunu takiben, iğne geri çekilmeli ve daha fazla kanamayı önlemek için üçüncü bağ derhal sıkılmalıdır. Dikişin sıkılmasından sonra kanama devam ederse, hayvana pentobarbital ile ötenazi yapılmalıdır.

4. Enjeksiyon sonrası iyileşme

1. {{}} yoluyla cerrahi sonrası ağrı kesici olarak deri altı enjeksiyonu.
2. Anesteziden kurtulmak için hayvanı ılık ve temiz bir kafese taşıyın. Bir hayvanın uyandıktan sonra bastırılmış aktiviteye sahip olması (toplanmış ve hareketsiz veya yavaş hareket etmesi) normaldir.
3. 30-45 dakika sonra fareleri uzun süreli bir bekletme tesisine aktarın.
4. Farelere ameliyattan sonra en az bir hafta boyunca yumuşak bir diyet (diyet jeli, hidrojel, püre) sağlayın ve yara bölgesi çevresinde felç, enfeksiyon ve kanama belirtileri için özel dikkat göstererek fiziksel durumu günlük olarak kontrol edin.
5. Ameliyattan iki gün sonra, hayvanın aktivitesinin azalması, hafif fırfırlı kürkü olması ve ameliyat öncesi vücut ağırlığının %15'ini kaybetmesi tipiktir. Ağrıyı yönetmek ve iyileşmeye yardımcı olmak için ameliyattan sonra 2-3 gün boyunca her gün analjezik (meloksikam) uygulayın.
6. 3. günden itibaren, hayvanlar yeniden aktivite kazanmış, beslenme ve tımar sıklığını artırmış ve yeniden kilo almış olmalıdır. Ameliyattan 4 gün sonra ameliyattan 4 gün sonra 200 mg / kg intraperitoneal enjeksiyon yoluyla sodyum pentobarbital enjekte ederek devam eden fiziksel durum eksiklikleri (ağrı, toplanmış, inaktif, kilo kaybı) olan hayvanlara ötenazi yapın.
7. Tümör aşılaması ve ilerlemesi, anestezi ve biyolüminesan görüntüleme, MRI veya PET/MRG gibi tercih edilen görüntüleme yöntemleri kullanılarak izlenebilir. Bu tür bir görüntülemeyi gerçekleştirme gerekliliği ve yeteneği, doğal olarak, projenin amaçlarına ve gerçekleştirildiği tesise bağlı olacaktır ve muhabirin türüne bağlı olarak, kullanılan hücre hatlarını, ilgili radyokimya ve nükleer görüntüleme tesislerinin erişilebilirliğini etiketleyecektir.
   NOT: Bazı hayvanlar başarılı bir işleme rağmen iyi yanıt vermeyebilir ve felç geçirebilir. İşlemden sonra, herhangi bir nörolojik sıkıntı belirtisi gösteren hayvanlar (başını çevirme ve bir tarafa çekme, daire çizme davranışı, yuvarlanma, dövülme, motor fonksiyon kaybı) derhal ötenazi yapılmalıdır.

Sonuçlar

Şekil 1: Beyin metastazı için internal karotis arter enjeksiyon protokolünün şematik gösterimi. Eksternal karotis arter ligasyonu ile internal karotis arter enjeksiyonu, çeşitli primer kanserlerden güvenilir bir beyin metastazı modeli üretebilir. Bu protokolde karotis arter üzerine üç ligatür yerleştirilir (şekilde L1-L3 olarak belirtilmiştir)....

Malzemeler

Bu makalede kullanılan malzemelerin listesi

Ad	Şirket	Katalog numarası	Yorumlar
30G Microlance needle	BD	23748
31G Ultra-Fine II insülin şırıngası	BD	326103
Açılı forseps	Proscitech	T67A-SS	İnce sivri, tırtıksız açılı, 18mm uç, uzunluk 128 mm
Animal heat mat
Antibiyotik ve antimikotik	ThermoFisher Scientific	15240062
BT-474 (HTB-20) meme kanseri hücre hattı	ATCC	HTB-20
Buprenorfin (TEMGESIC)
Kontes hücre sayacı	ThermoFisher Scientific	C10227
Diseksiyon mikroskobu
Kulak zımba
Elektrikli kesme makineleri
İnce açılı forseps	Proscitech	DEF11063-07	Açılı 45°, Uç pürüzsüz, Uç genişliği: 0,4 mm, Uç boyutu: 0,4 x 0,3 mm, uzunluk 9cm
Kanül için ince boru, Boru OD (inç) 1/32, Boru Kimliği (inç) 1/100 inç	Cole Parmer	EW-06419-00
Fetal sığır serumu	ThermoFisher Scientific	26140079
Hank'in kalsiyum ve magnezyum içermeyen Dengeli Tuz Çözeltisi	ThermoFisher Scientific	14170120
Isofluran
Kimwipes Low tiftikli tek kullanımlık silecekler	Kimberly Clark- Kimwipes	Z188964
Mashed mouse chow
Meloxicam (METACAM)
Burun konisi			Mikrofüj tüpünden şekillendirilmiş
PAA oküler kayganlaştırıcı (Karbomer 2mg/g)Bausch ve lomb	Povidon-iyot solüsyonu Betadine	2505692	PPE (eldiven, maske, cüppe, saç filesi)
Retractors	Kent Scientific	SURGI-5001
RPMI 1640 Media	ThermoFisher Scientific	11875093
Silk sütür 13mm 5-0, P3, 45cm	Ethicon	JJ-640G
Steril normal salin	ThermoFisher Scientific	TM4469
Yapışkan bant
Cerrahi tahta			Otoklavlanabilir torba ile sarılmış bir doğrama tahtası.
Cerrahi makas	Proscitech	T104	Uç Boyutları (LxD): 38x7mm, Uzunluk 115mm
Sütür forseps/ Kavisli Brophy forseps	Proscitech	T113C	Kavisli, Yuvarlatılmış dar 2 mm uç, tırtıklı, uzunluk 165 mm
Sütür iğnesi tutucusu (Olsen Hegar iğne tutucusu)	Proscitech	TC1322-180	uzunluk 190 mm, cırcırlı kelepçe
Ayak pedallı şırınga sürücüsü/ UMP3 Ultra mikro pompa	World Precision Instruments	UMP3-3
T75 doku kültürü şişesi	ThermoFisher Scientific	156499
Thread
Trigene II yüzey dezenfektanı	Ceva