İnsan Beyin Dokusundan İzole Edilen Nöromelanin Granüllerinin Proteomik Profilinin LC-MS/MS Analizi

Özet

Kaynak: Wulf, M., et.al. Nöromelanin granüllerinin proteomik profilinin LC-MS/MS Analizi için Lazer Mikrodiseksiyon Tabanlı Protokol. J. Vis. Uzm. (2021).

Bu video, insan ölüm sonrası beyin dokusundan izole edilen nöromelanin granüllerinden (NMG'ler) peptit örneklerinin analizini göstermektedir. Peptitler önce yüksek performanslı sıvı kromatografisi (HPLC) kullanılarak ayrılır ve daha sonra kütle-yük oranlarını (m/z) belirlemek için kütle spektrometresi ile analiz edilir. Hedeflenen peptitler, translasyon sonrası modifikasyonları tanımlamak için parçalanır ve elde edilen veriler, NMG'lerin proteomik profilini belirlemek için bir referans veri tabanı ile karşılaştırılır.

Protokol

1. Triptik sindirim

1. Numuneleri buz üzerinde çözün.
2. Numuneleri bir vakum yoğunlaştırıcıda tamamen kurutun.
3. Numuneyi 50 μL uygun bir sindirim tamponu, örneğin 50 mM amonyum bikarbonat ile doldurun.
4. 1.25 μL 200 mM 1,4-dithiothreitol eklendikten sonra, ....

Sonuçlar

Şekil 1: 120 dakikalık bir DDA ölçümünün Toplam İyon Akımı (TIC). Kromatogram, 0 ila ~105 dakika arasındaki tutma süresi aralığında elüsyon peptitlerine karşılık .......

Malzemeler

Bu makalede kullanılan malzemelerin listesi

Ad	Şirket	Katalog numarası	Yorumlar
1,4-dithiothreitol	AppliChem	A1101
Acetonitrile	Merck	1.00029.2500	Sigma-Aldrich	A6141
Formic acid	Sigma-Aldrich	56302
Iodoacetamide	AppliChem	A1666,0100
Micro Tube 500	Carl Zeiss	415190-9221-000	Thermo Fisher Scientific	IQLAAEGAAPFADBMBHQ
PALM MicroBeam	Zeiss	494800-0014-000
Trifluoroasetik asit	Merck	91707
Trypsin sequencing grade	Serva	37283.01<
Ultimate 3000 RSLC nano LC system	Thermo Fisher Scientific	ULTIM3000RSLCNANO
Yazılımın Adı	Weblink/Company	Version
FreeStyle	Thermo Fisher Scientific	1.6
MaxQuant	https://www.maxquant.org/	1.6.17.0
PALMRobo	Zeiss	4.6 pro
Perseus	https://www.maxquant.org/perseus/	1.6.15.0
Skyline	https://skyline.ms/project/home/software/Skyline/begin.view	20.2.0.343
XCalibur	Thermo Fisher Scientific	4.3

td style='border-left-style:none;border-top-style:none;width:120pt;'> =