İnsan Beyin Dokusundan İzole Edilen Nöromelanin Granüllerinin Proteomik Profilinin LC-MS/MS Analizi

Özet

Kaynak: Wulf, M., et.al. Nöromelanin granüllerinin proteomik profilinin LC-MS/MS Analizi için Lazer Mikrodiseksiyon Tabanlı Protokol. J. Vis. Uzm. (2021).

Bu video, insan ölüm sonrası beyin dokusundan izole edilen nöromelanin granüllerinden (NMG'ler) peptit örneklerinin analizini göstermektedir. Peptitler önce yüksek performanslı sıvı kromatografisi (HPLC) kullanılarak ayrılır ve daha sonra kütle-yük oranlarını (m/z) belirlemek için kütle spektrometresi ile analiz edilir. Hedeflenen peptitler, translasyon sonrası modifikasyonları tanımlamak için parçalanır ve elde edilen veriler, NMG'lerin proteomik profilini belirlemek için bir referans veri tabanı ile karşılaştırılır.

Protokol

1. Triptik sindirim

1. Numuneleri buz üzerinde çözün.
2. Numuneleri bir vakum yoğunlaştırıcıda tamamen kurutun.
3. Numuneyi 50 μL uygun bir sindirim tamponu, örneğin 50 mM amonyum bikarbonat ile doldurun.
4. 1.25 μL 200 mM 1,4-dithiothreitol eklendikten sonra, numuneleri bir termomikser kullanarak 60 °C ve 300 rpm'de 30 dakika inkübe edin ve daha sonra oda sıcaklığına (RT) soğutun.
5. Daha sonra, 1.36 μL 0.55 M iyodoasetamid ilavesinden sonra numuneleri karanlıkta 30 dakika RT'de inkübe edin.
6. Numunelere uygun miktarda tripsin ekleyin ve numuneleri gece boyunca (~ 16 saat) 37 ° C'de inkübe edin.
NOT: 1.000.000^μm2 için 0.1 μg tripsin yeterli bulunmuştur.
7. Sindirimi durdurmak için numunelere 2,6 μL %10 trifloroasetik asit (TFA) ekleyin (%0,5 TFA'nın son konsantrasyonu).
8. Numuneleri bir vakum yoğunlaştırıcı kullanarak tamamen kurutun. Ardından, numuneleri %0,1 TFA ile tanımlanmış bir nihai hacme kadar doldurun. NMG numuneleri 20 μL'ye kadar dolduruldu ve bunun 5 μL'si bir kütle spektrometrik (MS) deneyi için kullanıldı.
9. Numuneleri daha fazla kullanana kadar -80 °C'de saklayın. Peptit konsantrasyonunu amino asit analizi veya başka bir uygun miktar tayini yöntemi (örneğin, Doğrudan Algılama) ile belirleyin.
NOT: Düşük numune miktarları, belirtilen teknikler kullanılarak ölçülemeyebilir. Aynı numune yüklemesini sağlamak için, her numune aynı miktarda izole doku içermeli ve her numune eşit şekilde muamele edilmelidir.

2. Yüksek performanslı sıvı kromatografisi ve kütle spektrometresi

NOT: Aşağıdaki yüksek performanslı sıvı kromatografisi (HPLC) kütle spektrometrik (MS) analizleri, burada kullanılan bir yakalama sütunu cihazı ve kütle spektrometresi ile belirli LC sistemi için optimize edilmiştir (bkz.). Diğer LC ve MS sistemleri için parametrelerin uyarlanması önerilir.

1. Xcalibur yazılımını kullanarak HPLC ayarlarını aşağıdaki gibi yapın.
   1. Tuzak sütunu: Sıcaklığı 60 °C'ye, akış hızını 30 μL/dk'ya, çalışma tamponunu %0,1 trifloroasetik aside ayarlayın.
   2. Analitik C18 ters fazlı sütun: Sıcaklığı 60 °C'ye, akış hızını 30 μL/dk'ya, çalışma tamponu A'yı %0.1 trifloroasetik asite, çalışma tamponu B'yi %84 asetonitril'e ve gradyanı 5 dakika boyunca %30-%98 çalışma tamponu B'ye ayarlayın.
      NOT: Degradenin adaptasyonu kaçınılmaz olabilir ve farklı dokular veya hücreler kullanılırken şiddetle tavsiye edilir. Toplam gradyan süresi, gradyanın başlangıcında numune yüklemesi ve gradyanın sonunda numune yıkaması nedeniyle değişebilir. Bu protokoldeki toplam gradyan, 7 dakikalık numune yükleme ve 15 dakikalık ek kolon yıkamadan oluşur ve bu da toplam 120 dakikalık bir gradyan süresi ile sonuçlanır.
2. HPLC yazılımı yol haritası menüsünde bulunabilen XCalibur Instrument Setup'ı kullanarak veriye bağlı bir edinim (DDA) yöntemi oluşturun.
3. Global Parametreler sekmesinde, infüzyon modu Sıvı Kromatografisi, Beklenen LC Tepe Genişliği (30 s) ve Varsayılan şarj durumunu (2) tanımlayın.
4. Tarama Parametreleri sekmesine ilerleyin ve aşağıdaki taramaları ve filtreleri belirtilen sırayla ekleyin: MS OT, MIPS, Yoğunluk, Şarj Durumu, Dinamik dışlama ve ddMS2 OT HCD.
   Optimum MS ve DDA ayarları, kullanılan spesifik kütle spektrometresinin yanı sıra numune tipine göre de değişebilir ve bu nedenle uyarlanmalıdır.
5. 200-400 ng numune peptidini inert kütle spektrometrik cam flakon girişlerinde tanımlanmış %0.1 TFA hacminde çözerek numune hazırlayın. Düşük numune miktarı nedeniyle konsantrasyon belirlemesi uygulanamıyorsa, Toplam İyon Akımını (TIC) karşılaştırarak aynı numune yüklemesini doğrulayın.
   NOT: Bunu yapmak için, elde edilen kütle spektrometrik ölçüm dosyasını uygun bir yazılımda, örneğin FreeStyle'da açın ve kromatogramı kontrol edin. Yoğunluklar tüm numuneler için karşılaştırılabilir olmalıdır. Temsili bir TIC Şekil 1'de gösterilmiştir.
6. MaxQuant, Progenesis QI for Proteomics veya Proteome Discoverer gibi proteomik uygun bir yazılım kullanılarak elde edilen ham verileri analiz edin ve araştırma sorusuna dayalı bir istatistiksel veri analizi yapın.

3. MaxQuant

1. Yükle'yi tıklayarak raw veri başlığındaki MaxQuant yazılımına raw dosyaları yükleyin.
2. Deney Ayarla'ya tıklayarak örnek adlar atayın.
3. Gruba özgü parametreleri tanımlayın. İlk olarak, değişiklikleri ekleyin. Numune işleme nedeniyle, değişken modifikasyonlar olarak Deamidasyon (NQ), Oksidasyon (M) ve Karbamidometilasyonu (N-term) seçin ve sabit modifikasyon olarak Karbamidometilasyon (C) ekleyin.
4. Sindirim sekmesinde sindirim enzimi olarak Tripsin'i seçin.
5. Etiketsiz niceleme seçeneği LFQ'yu Etiketsiz Niceleme sekmesine ekleyin. 10'dan fazla dosya işlenecekse, işlem süresini kısaltmak için Hızlı LFQ seçeneğini seçin. Protein miktar tayini için bir ölçü olarak iBAQ seçeneğini ekleyin.
6. Gruba özgü diğer tüm parametrelerin fabrika ayarlarında kaldığından emin olun.
7. Global Parametreler sekmesine ilerleyin ve Diziler sekmesinde uniprot.org'den türetilen FASTA dosyasını ekleyin. Tanımlayıcı kuralını uygun şekilde değiştirin ve taksonomi kimliğini, bu durumda homo sapiens için 9606'yı ekleyin.
8. Protein ölçümü için Unique ve Razor peptitlerini seçin.
9. Diğer tüm genel parametrelerin fabrika ayarlarında kaldığından emin olun.
10. Perseus'ta daha fazla analiz için MaxQuant analizinden sonra Başlat'a tıklayın ve proteingroups.txt çıktısını alın.

Sonuçlar

Şekil 1: 120 dakikalık bir DDA ölçümünün Toplam İyon Akımı (TIC). Kromatogram, 0 ila ~105 dakika arasındaki tutma süresi aralığında elüsyon peptitlerine karşılık ...

Malzemeler

Bu makalede kullanılan malzemelerin listesi

Ad	Şirket	Katalog numarası	Yorumlar
1,4-dithiothreitol	AppliChem	A1101
Acetonitrile	Merck	1.00029.2500	Sigma-Aldrich	A6141
Formic acid	Sigma-Aldrich	56302
Iodoacetamide	AppliChem	A1666,0100
Micro Tube 500	Carl Zeiss	415190-9221-000	Thermo Fisher Scientific	IQLAAEGAAPFADBMBHQ
PALM MicroBeam	Zeiss	494800-0014-000
Trifluoroasetik asit	Merck	91707
Trypsin sequencing grade	Serva	37283.01<
Ultimate 3000 RSLC nano LC system	Thermo Fisher Scientific	ULTIM3000RSLCNANO
Yazılımın Adı	Weblink/Company	Version
FreeStyle	Thermo Fisher Scientific	1.6
MaxQuant	https://www.maxquant.org/	1.6.17.0
PALMRobo	Zeiss	4.6 pro
Perseus	https://www.maxquant.org/perseus/	1.6.15.0
Skyline	https://skyline.ms/project/home/software/Skyline/begin.view	20.2.0.343
XCalibur	Thermo Fisher Scientific	4.3

td style='border-left-style:none;border-top-style:none;width:120pt;'> =