$$\rightleftharpoonup{xx}$$
$$\longleftharp{xx}$$,
$$\longrightharp{xx}$$,
1. Tekrarlanabilir boyutta tümör sferoidlerinin üretilmesi
- Diffüz Orta Hat Gliomu (DMG) H3K27M-mutant nöroküreleri (NS) toplayın ve 170 x g.
- NS'yi parçalamak için, 500 μL akaktaz çözeltisini 37 ° C'de 3 dakika inkübe edin.
- Accutase solüsyonunu tümör kök hücresi (TSM) ile nötralize edin medium7 ve santrifüj 355 x g.
- Hücre peletini 1 mL TSM ortamında yeniden süspanse edin ve ardından hücreleri bir hücre sayma odası kullanarak kontrol edin.
- 2,5-5 x 10 style='font-family:Roboto,sans-serif;font-size:0.6em;font-style:normal;font-variant:normal;font-weight:400;text-decoration:none;vertical-align:baseline;white-space:pre-wrap;'3 hücreler/mL ve tohum 100 μL/kuyu ultra düşük bağlantı (ULA) 96 oyuklu yuvarlak tabanlı plakalara (bkz. Table of Materials). Hücre tohumlamasından 4 gün sonra ~ 300 μm çapında bireysel NS elde etmek için uygun bir hücre yoğunluğu kullanın (oldukça agresif glioma hücreleri için 250-500 hücre / kuyu).
- Hücre tohumlamasından 4 gün sonra ters mikroskop kullanarak NS oluşumunu görsel olarak doğrulayın.
2. Antikor etiketleme reaktifi (ALR)/antikor kompleksinin hazırlanması ve migrasyon testi için kurulum
- Her reaktif için gereken hacmi analiz etmek ve hesaplamak için kuyucuk sayısını göz önünde bulundurun. Negatif kontroller için gerekli olan kuyuları da dahil edin. Başlamadan önce ters çevrilmiş bir mikroskop kullanarak NS'yi görsel olarak kontrol edin.
- Düz tabanlı 96 oyuklu plakalar kullanın. Kaplamayı gerçekleştirin. Bu çalışma için ince bir kaplama olarak bazal membran matrisi (BMM) kullanılmıştır.
- Kaplama hazır olduğunda, fazla BMM kaplamasını bir p200 ucu ile çıkarın, ucu kuyunun kenarına yerleştirin ve tabana dokunmaktan kaçının. Birden fazla kuyucukla çalışıyorsanız, çok kanallı bir pipet kullanın.
- Bir p200 ucu kesin, seçilen her kuyucuktan 50 μL hücre ortamı + NS alın ve kaplanmış düz tabanlı bir kuyuya aktarın. Her bir kuyucuktaki NS'nin varlığını ve konumunu görsel olarak kontrol edin.
NOT: Her NS, kuyuda merkezi bir konuma yerleştirilmelidir. Aktarım sırasında kuyunun kenarındaki uca yaslanmaktan kaçının, ancak ortamı dibe dokunmadan kuyunun ortasına bırakın. Yüksek oranda göç eden hücreler için, standart üç kopyadan daha fazla sayıda kopya düşünün. Bunun nedeni, NS'nin kuyunun kenarına çok yakın oturduğunda, göç eden hücrelerin kuyunun daha küçük bir alanını kaplayabilmesidir. - Reaktifi rehidre etmek için ALR'ye 100 μL steril su ekleyin (nihai konsantrasyon = 0.5 mg / mL). Çözeltiyi karıştırmak için pipetleyin. NOT: Reaktif ışığa duyarlıdır; Bu nedenle, karanlıkta tutun. Kalan reaktifi ayırın ve -80 °C'de saklayın (donmayı ve çözülmeyi önleyin).
- Antikoru ALR ile uygun tam hücre büyüme ortamında, yuvarlak tabanlı çok kuyulu bir plakada veya kehribar bir tüpte karıştırın ve ışıktan koruyun. 3x nihai tahlil konsantrasyonunda 50 μL / kuyu dağıtmak için yeterli miktarda hazırlayın. RT'de 15 dakika inkübe edin.
- Testin sonunda 0,5 mM'lik bir nihai konsantrasyon elde etmek için arka plan baskılayıcı reaktifini (BSR) TSM ortamında (veya tercih edilen hücre hattı için uygun hücre büyüme ortamında) 1,5 mM'de (3x) seyreltin.
NOTE: Reaktif ışığa duyarlıdır. İyi kullanım prosedürleri için yukarıya bakın. - Her kuyucuğa yavaşça 50 μL BSR ekleyin.
- Her kuyucuğa nazikçe 50 μL ALR / antikor ekleyin. Reaktiflerin karışmasına izin vermek için 2 veya 3 dakika bekleyin ve replike NS'lerin çoğunun kuyuda merkezi olarak yerleştirildiğinden emin olmak için ters çevrilmiş bir mikroskop kullanarak görsel olarak kontrol edin.
- Kabarcık oluşumunu önleyin ve bir iğne kullanarak mevcut olanları çıkarın. Plakayı, 37 °C, %5 CO2,% 95 nem.
3. Görüntü alımı için canlı hücre analiz cihazı ayarı
- Canlı hücre analiz cihazını kullanarak plakaları tarayın (özellikler için bkz. Tablo Materials) adım 2.14'ten sonra ayarlanan invazyon ve migrasyon tahlillerinin sıfır zaman noktasından (t0) başlayan tarama aralıklarıyla. ve 3.10. 96 saate kadar.
NOTE: Canlı hücre analiz cihazını, istila ve migrasyon tahlilinin başlamasından hemen sonra imha edebildiğinizden emin olun. Tümör tipine bağlı olarak, hücreler tahlil kurulumundan itibaren 1 saat içinde NS'yi istila etmeye veya göç etmeye başlayabilir. - Canlı hücre analiz cihazı yazılımında, Schedule to Acquire" seçeneğini belirleyin. + sekmesine tıklayın ve seçeneği belirleyin Scan on Schedule.
- Yazılım penceresinde Create or Restore Vessel, seçeneğe tıklayın New.
- İstila ve göç edinimi için canlı hücre analiz cihazında belirli uygulamayı seçin. Select Spheroid tarama türü, 4x objektif, Phase+Brightfield ve Green istila testi için görüntü kanalları. Select Dilution Cloning tarama türü, 4x objektif ve Phase and Green geçiş tahlili için.
- Plaka tipini seçin ve taranacak kuyuları plaka haritası üzerinde vurgulayarak tanımlayın.
- Tarama frekansını ayarlayın (bu protokoldeki deneyler için tarama frekansı istila için 15 dakika ve göç için 30 dakika idi).
- Schedule üzerine tıklayın ve taramayı başlatın.