$$\rightleftharpoonup{xx}$$
$$\longleftharp{xx}$$,
$$\longrightharp{xx}$$,
1. İnce bağırsak nöroendokrin tümörü (SBNET) toplama ve hücre ayrışması
- Cerrahi Patoloji Çekirdeği'nden tümör dokusu doğrulamasından sonra rezeke edilen hasta SBNET örneklerini alın.
- SBNET'leri 5 mm'lik küpler halinde kesin ve laboratuvara taşımak için konik bir tüpte 25 mL Dulbecco'nun Modifiye Kartal Ortamı (DMEM)/F12 ortamında saklayın.
- Tümörleri %1 fetal sığır serumu veya FBS, %1 penisilin / streptomisin (Pen / Strep) ve% 1 glutamin (Yıkama Ortamı) içeren DMEM'e aktarın ve bu Yıkama Ortamında 15 dakika inkübe edin.
- Tümörleri yeni bir tabağa aktarın ve steril kavisli makas kullanarak çapı 1 mm'den küçük parçalar halinde kıyın.
- Kıyılmış dokuları 25 mL Yıkama Ortamı içeren 50 mL'lik yeni bir tüpe aktarın.
- Numuneyi 500 x g'de 4 °C'de 15 dakika santrifüjleyin.
- Süpernatanı atın ve peletleri kollajenaz (100 U/mL) ve DNaz (0.1 mg/mL) içeren 10 mL Yıkama Ortamında yeniden süspanse edin.
- Kıyılmış tümörlerin 37 °C'lik bir inkübatörde yavaş çalkalanarak (50 rpm) 1,5 saat boyunca sindirilmesine izin verin.
2. Ekstra Hücresel Matrikste (ECM) tümör sferoidleri olarak SBNET'lerin kültürü
- Sindirim tamamlandıktan sonra (adım 1.8), 500 x g'de 4 °C'de 15 dakika santrifüjleyin, süpernatanı atın ve peleti 15 mL Yıkama Ortamında yeniden süspanse edin.
- Yeni 50 mL'lik bir tüpün üzerine 70 μm'lik bir hücre süzgeci yerleştirin ve 10 mL Yıkama Ortamını hücre süzgecinin üzerine aktarın. NET hücrelerinin plastik tüpün yan tarafına yapışmasını önlemek için plastik tüpün yan tarafını kaplayacak şekilde Yıkama Ortamını döndürün.
- Hücre süspansiyonunu bir hücre süzgecinden geçirin.
- 500 x g'de 4 °C'de 15 dakika santrifüjleyin, süpernatanı atın, peleti 200 μL Yıkama Ortamında (toplam hacim ~ 250 μL'dir) yeniden süspanse edin ve buzun üzerine yerleştirin.
- 5 μL hücreyi 500 μL Yıkama Ortamına (1/100 seyreltme faktörü) aktarın. Mililitre başına hücre sayısını elde etmek için bir hemositometre kullanarak hücre sayımı için seyreltilmiş hücreleri kullanın. Seyreltme faktörünü düzeltmek için 100 ile çarpın.
- Adım 2.5'te elde edilen mL başına hücre sayısını, adım 2.4'te (~ 250 μL) elde edilen süspansiyondaki toplam hücre hacmi ile çarpın.
- 500 x g'de 4 °C'de 15 dakika santrifüjleyin, süpernatanı atın ve hücreleri sıvı ECM'de (1 x 106 hücre/mL) yeniden süspanse edin ve buz üzerinde tutun.
- ECM'deki 5-20 μL SBNET sferoidlerini 96 oyuklu bir plakaya aktarın ve plakayı 5 dakika boyunca 37 °C'lik bir inkübatöre yerleştirerek sıvı ECM'nin katılaşmasına izin verin.
- {{}} 200 μL SBNET kültür ortamı (DMEM/F12 + %10 FBS + %1 PEN/STREP + %1 Glutamin + 10 mM nikotinamid + 10 μg/mL insülin) ekleyin ECM'de SBNET sferoidlerini içeren.
- Alternatif olarak, insan karaciğeri veya pankreas organoidlerini büyütmek için daha önce tarif edilene benzer ve Malzeme Tablosu'nda listelenene benzer şekilde kök hücre ortamında SBNET organoidlerini kültürleyin.
- Medyayı her 5-7 günde bir değiştirin.
3. SBNETS sferoidlerinin immünofloresan ile karakterizasyonu
- ECM'de büyütülen organoidleri bir P1000 pipeti kullanarak 1,5 mL'lik bir tüpe aktarın.
- 1.500 x g'de 1 dakika santrifüjleyin ve süpernatanı çıkarın.
- Organoid kültürü 1 mL fosfat tampon salin veya PBS ekleyerek yıkayın, karıştırın, 1.500 x g'de 1 dakika santrifüjleyin ve süpernatanı çıkarın.
- 500 μL% 4 paraformaldehit ekleyerek organoidleri sabitleyin ve 15 dakika inkübe edin.
- Kültürü 1 mL PBS ile iki kez yıkayın.
- 5 dakika boyunca 500 μL PBS +% 3 Sığır serum albümini veya% 0.1 Triton X 100 ekleyerek kültürü geçirgen hale getirin.
- Ardından, 1 mL PBS +% 3 BSA ile üç kez yıkayın.
- Antikor tamponunda 1/600 dilüsyonda sinaptofizin (SYP) veya kromogranin A (CgA) ve somatostatin reseptörü 2'ye (SSTR2) karşı primer antikorlarla 1/400 seyreltmede 1 saat inkübe edin (% 2.5 sığır serum albümini,% 0.1 sodyum azid, 25 mM Tris pH 7.4, 150 mM sodyum klorür).
NOT: Tüp başına 300 μL veya daha fazla antikor çözeltisi kullanın. - 1 mL PBS +% 3 BSA ile üç kez yıkayın.
- 1 saat boyunca antikor tamponunda 1/500 seyreltmede FITC'ye bağlı ikincil antikorlarla inkübe edin. Tüp başına 300 μL veya daha fazla antikor çözeltisi kullanın.
- 1 mL PBS +% 3 BSA ile 3 kez yıkayın. Tüm süpernatanı aspire ettiğinizden ve attığınızdan emin olun.
- Nükleer leke DAPI içeren 5 μL montaj ortamı ekleyin.
- Adım 4.12'den itibaren 5 μL SBNET sferoidlerini bir cam kızağa aktarmak için bir P20 pipeti kullanın ve bir kapak kızağı ile kapatın.
- 10x, 20x veya 40x objektifleri kullanarak floresan mikroskop kullanarak görüntü alın.