Akut Fare Beyin Dilimlerinde Oksijen Tüketim Hızının Ölçülmesi

Özet

Kaynak: Zhi, L. ve ark., Yetişkin Farelerden Alınan Akut Striatal Dilimlerde Oksijen Tüketim Oranının Ölçümü. J. Vis. Uzm. (2022).

Bu video, fare striatal beyin dilimlerinde mitokondriyal oksijen tüketim oranının (OCR) nasıl ölçüleceğini göstermektedir. Doku plakasını ve sensör kartuşunu hazırlama, bunları akı analizörüne yükleme adımlarını detaylandırır ve OCR modellerinin altında yatan hücresel süreçleri açıklar.

Protokol

Hayvan örneklerini içeren tüm prosedürler, uygun hayvan etik inceleme komitesi tarafından gözden geçirilmiş ve onaylanmıştır.

1. Hidrat kartuş sensörleri (testten 1 gün önce)

1. Hücre dışı akı test kitini açın (bkz. Malzeme Tablosu) ve hem sensör kartuşunu (yeşil) hem de yardımcı plakayı (şeffaf; Şekil 1A). Sensör kartuşunu bir kenara koyun (sensörler yukarı) ve sensörlere dokunmayın.
2. Yardımcı plakanın her bir oyuğuna 600 μL kalibrant çözeltisi (pH 7.4) ekleyin. Sensör kartuşunu yardımcı plakanın üzerine yerleştirin ve sensörleri kalibant solüsyonuna daldırın. Yardımcı programın ve sensör kartuş plakasının üçgen çentiğinin doğru şekilde hizalandığından emin olun (Şekil 1B).
3. Kalibant çözeltisinin buharlaşmasını önlemek için hücre dışı akı test kitini sızdırmazlık filmi ile kapatın ve ardından gece boyunca CO₂ veya oksijen ile desteklenmemiş 37 °C'lik bir inkübatöre yerleştirin.

2. Doku plakasını hazırlayın (tahlil günü)

1. {{}} Adacık yakalama mikroplakasını açın ve doku oturması için adacık plakasını çıkarın.
2. Önceden oksijenlenmiş modifiye edilmiş yapay beyin omurilik sıvısının (ACSF, bileşim 140 mM NaCl, 2.5 mM KCl, 2.4 mM CaCl₂, 1.3 mM MgSO₄, 0.3 mM KH₂PO₄, 25 mM glikoz, 10 mM HEPES, pH 7.2) 50 mL'lik bir tüpte 37 °C'ye kadar tamponlayın. Daha sonra solunum tamponunu hazırlamak için BSA'yı 4 mg / mL'lik bir son konsantrasyona ekleyin. Genel olarak, bir tabak için 50 mL yeterlidir.
3. Adacık plakasının her bir oyuğuna dikkatlice 625 μL solunum tamponu (25 mM glikoz ve 4 mg / mL BSA ile önceden oksijenlenmiş ACSF tamponu) ekleyin ve plakayı sallamaktan kaçının. Sensör kartuşunun üzerinde artık damla olmadığından ve her bir kuyucuğun tamponunda hava kabarcığı bulunmadığından emin olun.

3. Akut striatal kesit hazırlama ve eksize edilmiş dilim yerleştirme

1. {{}}Servikal çıkıktan sonra farenin kafasını kesin ve beyni hemen 10 mL buz gibi soğuk önceden oksijenlenmiş kesme solüsyonunda (125 mM NaCl, 2.5 mM KCl, 26 mM NaHCO₃, 3.7 mM MgSO₄, 0.3 mM KH₂PO₄, 10 mM glikoz, pH 7.4).
2. Buz gibi, önceden oksijenlenmiş kesme çözeltisinde 150 μm kalınlıkta, üreticinin talimatına (bkz. Malzeme Tablosu) uygun olarak vibratomlu koronal striatal dilimler kesiti.
3. Dilimleri 50 mL oksijenli ACSF'de geri kazanın (125 mM NaCl, 2.5 mM KCl, 26 mM NaHCO₃, 2.4 mM CaCl₂, 1.3 mM MgSO₄, 0.3 mM KH₂PO₄, 10 mM glikoz, 2 mM HEPES, pH 7.4) ve oda sıcaklığında (RT) 30 dakikaya kadar çözelti içinde tutun.
4. Geri kazanımdan sonra, dilimleri 5 mL solunum tamponu ile 35 mm x 10 mm'lik bir Petri kabına aktarın.
5. Dilimlenmiş beynin istenen bölgesinde dairesel bir doku parçası oluşturmak için paslanmaz çelik bir biyopsi zımbası (örneğin, 1,5 mm çap) kullanın. Zımba ile hafifçe bastırırken dilimi tamponda tutun. Zımbanın dokuyu kesmek için yeterince sert bastırıldığından emin olun. Dokunun geri kalanını çıkarın, zımbayı kaldırın ve dairesel doku parçasını tampona çıkarın.
6. 1,5-2,0 mm çapında bir delik açmak için 1 mL'lik bir pipet ucunun en ucunu kesin ve delinmiş dilimi tutmak ve yakalama ekranının üst kısmına aktarmak için kullanın. Delinmiş beyin dokusundan bir parça emdirin ve dokuyu dikkatlice yakalama ekranının ağ tarafına yerleştirin (Şekil 2A). Yakalama ekranı, ağ bir tarafa bağlı dairesel bir plastik parçası olacaktır.
   NOT: Yakalama ekranları mikroplaka paketine dahildir (bkz. Malzeme Tablosu).
7. Yakalama ekranını kısa bir süre kurutmak için nazikçe bir kağıt mendil kullanın. Nem uzaklaştırıldığında, doku yapışkan hale gelir ve bu da dilimin ağın merkezine yapışmasını sağlar. Dilimi çok fazla kurutmayın, aksi takdirde zarar görür.
8. Yakalama ekranı dilimini cımbızla aşağı bakacak şekilde tutun ve kuluçka adacık plakasının kuyularından birine yerleştirin (Şekil 2B). Dilimi düşürmemeye dikkat edin; Eğer öyleyse, ekranı çıkarın ve üzerine yeni bir dilim yerleştirin.
   NOT: Beyin dilimlerini adacık plakasındaki iki arka plan düzeltme kuyusuna (A1 ve D6) yerleştirmeyin.
9. Testi çalıştırmadan önce sıcaklık ve pH dengesine izin vermek için adacık plakasını 37 ° C'de bir inkübatörde en az 30 dakika inkübe edin.

4. İstenilen bileşiklerle kartuşların yüklenmesi

1. İstenen bileşikleri modifiye ACSF'de (37 °C) A'dan D'ye kadar olan portlar için sırasıyla çalışma konsantrasyonunun 10x, 11x, 12x ve 13x'i olan nihai stok konsantrasyonuna seyreltin ve pH 7.4'e ayarlayın. Test, bileşikleri port A'dan D'ye kadar sırayla uygulayacaktır. Bu deney için, daha önce belirtilen ilgili çalışma konsantrasyonları ile aşağıdaki çözeltiler kullanıldı: 10 mM piruvat (port A), 20 μM oligomisin (port B), 10 μM veya diğer konsantrasyonlarda karbonil siyanür 4- (triflorometoksi) fenilhidrazon (FCCP) (port C) ve 20 μM antimisin A (port D).
2. 75 μL seyreltilmiş bileşiği sensör kartuşunun uygun enjeksiyon portlarına yavaşça önceden yükleyin. Uçları, uç enjeksiyon portunun duvarına dayanacak şekilde 45°'lik bir açıyla enjeksiyon portlarının yarısına kadar yerleştirin. Uçlar, enjeksiyon portlarının altına tamamen sokulmamalıdır, çünkü bu, porttan bileşik sızıntısına neden olabilir.
3. Hava kabarcıkları oluşmasını önlemek için uçları bağlantı noktalarından dikkatlice çekin. Hava kabarcıklarını hafifletmemek için kartuşun herhangi bir kısmına dokunmayın.
4. Eşit yükleme için enjeksiyon portlarını görsel olarak inceleyin. Tüm sıvının bağlantı noktasında olduğundan ve kartuşun üzerinde artık damla bulunmadığından emin olun.
5. Sensör kartuşunu yardımcı plakaya yerleştirin ve tekrar 37 °C'ye kadar ısınmasını sağlamak için 30 dakika boyunca bir inkübatöre (CO olmayan₂) koyun. Yalnızca yardımcı plakayı tutarak dikkatli bir şekilde tutun. Mümkün olduğunca az hareket edin.

5. Kalibrasyon ve tahlilin gerçekleştirilmesi

1. Test şablonunu yazılıma yükleyin. Yeşil START düğmesine basın.
2. Doğru protokolü yüklediğinizden emin olun. Protokol, 3 dakikalık karışım, 3 dakikalık bekleme ve 2 dakikalık ölçüm dizilerinin bir kombinasyonunu içerir (bu üç adım tek bir ölçüm oluşturur). Cihaz ayarları altındaki donanım ayarlarında prob kafasının mesafesini 26.600'den 27.800'e değiştirin. XFe24 analizörü için prob kafasını değiştirmeye gerek yoktur. START tuşuna basın.
3. Yardımcı program plakasındaki sensör kartuşunu alet tepsisine yerleştirin. Çentik sol ön köşeye gider. Plakanın doğru oturduğundan ve düz olduğundan emin olun. İlaçla doldurulmuş sensör kartuşunu kalibrasyon için analizöre yükleyin.
4. Sensörleri kalibre etmek ve dengelemek için ekrandaki talimatları izleyin. Bu işlem yaklaşık 30 dakika sürer.
5. Kalibrasyon adımı tamamlandıktan sonra, kalibrasyon plakasını çıkarın ve adacık plakasıyla (ağ ve doku dilimlerini içeren) değiştirin.
6. Tahlil protokollerini kullanarak plakanın her bir oyuğundaki oksijen tüketimini ölçün. Protokol, 3 dakikalık karıştırma, 3 dakikalık bekleme ve 2 dakikalık ölçüm dizilerinin bir kombinasyonunu içerir (bu üç adım tek bir ölçüm oluşturur), bu noktada oksijen tüketim oranı (OCR) hesaplanır.
7. Tüm deney için, bir temel oluşturmak için 4x OCR ölçümlerini, ardından 4x ölçümlerle port A'nın (piruvat) enjeksiyonunu, ardından 8x ölçümle port B'nin (oligomisin) enjeksiyonunu, ardından port C'nin enjeksiyonunu (FCCP) 5x ölçümle ve son olarak, 6x ölçümle port D'nin (antimisin A) enjeksiyonu.
   NOT: Her bileşik enjeksiyondan sonraki bu ölçüm sayısı, ölçümün platoya ne zaman ulaştığına bağlı olarak belirlenir.
8. OCR ölçüm verilerini ve kaplin verimliliği verilerini analiz edin.

Sonuçlar

Şekil 1: Hücre dışı akı analizörünü, hidrat kartuşunu, sensörleri ve plakayı gösteren görüntüler. (A) Bir kalibrasyon plakasının (yardımcı plaka) üzerinde oturan sensör kartuşu. (B) Yardımcı plakanın ve sensör kartuş pla...

Malzemeler

Bu makalede kullanılan malzemelerin listesi

Ad	Şirket	Katalog numarası	Yorumlar
Accumet AB150 pH tezgah üstü ölçüm cihazı	Thermo Fisher Scientific	13-636-AB150	To measure pH
Antimisin A'dan Streptomyces sp.	SIGMA	A8674	Mitokondrinin kompleks III'ünü inhibe etmek<
Sığır Serumu Albümini (BSA)	SIGMA	A6003	Modifiye yapay beyin omurilik sıvısı yapmak için (BSA-ACSF)
Karbonil siyanür 4-( triflorometoksi) fenilhidrazon (FCCP)	SIGMA	C2920	To uncouple mitokondrial solunum
D-Glucose<	G8270	To make artificial beyin omurilik sıvısı (ACSF)
DMSO	SIGMA	D8418	To dissovle compounds
HEPES	SIGMA	H3375	To make artificial beyin omurilik sıvısı (ACSF)
Nemlendirilmiş karbondioksit olmayan inkübator	Fisher Scientific	11-683-230D	Plakaları 37 °C'de nemlendirmek
Streptomyces diastatochromogenes'ten oligomisin	SIGMA	O4876	Mitokondriyal ATP sentazı inhibe etmek
Parafilm	SIGMA-ALDRICH		sealing film
Seahorse XF Calibrant Solution 500 mL	Denizatı Biyobilimi	103681-100<
Seahorse XF Hücre Dışı Akı Analizörü	Seahorse Bioscience		Oksijen tüketim oranını analiz etmek için kullanılan ekipman, old generation
Denizatı XFe24 Hücre Dışı Akı Analizörü	Seahorse Bioscience		Oksijen tüketim oranını analiz etmek için kullanılan ekipman, new generation
Denizatı XF24 FluxPaks	Seahorse Bioscience	101174-100	Akı analizörü sensör kartuşları, doku kültürü plakaları, yakalama ekranları, kalibrant solüsyonu ve kalibrasyon plakaları paketi; tahlil kiti.
Sodyum piruvat	SIGMA	P2256	To prevent any substrate-limite-constraints of substrate supply
Paslanmaz çelik biyopsi punches	Miltex		Dilimleri delmek için kullanılan cihaz
Steril hücre kültürü kabı, 35 x 10 mm	Eppendrof	30700102	Used for slice punch
Vibratom	Leica	VT1200	To slice brain tissue
Water bath	Thermo Scientific Precision	282-115	To heat buffer and solutions

tr style='height:19px;'>td style='overflow:hidden;padding:0px 3px;vertical-align:top;'>SIGMA içintd style='overflow:hidden;padding:0px 3px;vertical-align:top;white-space:normal;word-wrap:break-word;wrap-strategy:4;'>Denizatı kalibrasyonu için çözüm