Beyin Kanseri Hücre İstilasının Empedans Tabanlı Ölçümleri

Özet

Kaynak: Mudduluru, G., et. al. Kanser Hücresi Göçü ve İstilasının Empedans Tabanlı Gerçek Zamanlı Ölçümü. J. Vis. Uzm. (2020)

Bu video, glioblastoma hücre istilasını ve göçünü ölçmek için empedans tabanlı bir testi göstermektedir. Hücreler hücre dışı matrisi bozar, mikro gözenekli zarlardan geçer ve elektrotlara yapışarak empedans oluşturur. Bu gerçek zamanlı analiz, kanser araştırma uygulamaları için istilacı potansiyellerini yansıtıyor.

Protokol

1. Gerçek Zamanlı Hücre Analiz Sistemi, Hücre İnstilası ve Göçü (CIM) Plakaları ve Kaplama için Elektroporasyonlu U-118MG Hücrelerinin Hazırlanması

1. ₂ kültür koşulları altında 5-6 saat önce Sistemi kültür koşullarına stabilize etmek için deneyin başlangıcı.
2. İstila testi için, CIM plakasının üst odasının her bir oyuğunda 0.1 μg / μL'de hücre dışı matris (ECM) jeli içeren 50 μL DMEM (düz ortam) plakası. Hava kabarcığı oluşmasını önlemek için ters pipetleme yöntemini kullanın. Hemen 30 μL ECM jeli çıkarın ve 20 μL'yi kuyucukta bırakın.
3. ECM jel kaplamadan sonra, plakayı kapağı kapalı olarak 4 saat boyunca kültür koşullarında inkübatörde tutun. ECM jel kaplama ve kurutma sırasında, plakaların üst bölmesinin elektrotlarıyla ellerle, biyogüvenlik kabininin yüzeyleriyle veya CO₂ inkübatörüyle doğrudan teması önlemek için önleyici tedbirler alın.
4. Empedans ölçüm programını kurmak için, sistem yazılımı uygulamasını (kontrol ünitesi) açmak için ilgili yazılım simgesine (bkz. Malzeme Tablosu) çift tıklayın. Her kızak, deney koşullarını, empedansı, zaman aralığını ve süreyi ölçmek ve veri analizini ayarlamak için farklı sekmelere sahip ayrı bir pencereye sahiptir.
5. Layout sekmesi altında, her biyolojik durum için dörtlü kuyular ayarlayın ve Schedule sekmesi altında iki aşamalı hücre empedansı ölçümlerini ayarlayın. İlk adım, bir kerelik temel ölçüm içindir (1 dakikalık aralıklarla bir tarama) ve ikinci adım, gerçek bir deney için ilgili ayrı yuvalardaki hücre empedansını ölçmektir. Geçiş için, 10 dakikalık aralıklarla 145 tarama ve istila için 10 dakikalık aralıklarla 577 tarama, ayrı ayrı ayarlanmış) kullanın.
6. Hücre empedansı ölçümünün başlamasından bir saat önce, plakanın alt odasının kuyucuklarına kemoatraktan olarak% 10 FBS ile 160 μL DMEM ekleyin. İstila ve göçü ölçmek için sırasıyla ECM jel kaplı kuyucukları içeren üst hazneyi veya kaplanmamış hazneleri alt hazne ile birleştirin.
7. Üst haznedeki kuyucukları 50 μL düşük serum ortamı ile doldurun ve bunları sistemin beşiğine yerleştirin. Message sekmesine tıklayarak tüm kuyuların kontrol ünitesi tarafından tanınıp tanınmadığını kontrol edin. Mesaj Tamam şeklinde görüntüleniyorsa, beşikteki plaka deney için hazırdır.
8. {{}} Gerçek zamanlı hücre analiz sistemi beşiğindeki ölçümlerden önce tamamen paketlenmiş plakaları kültür koşulları altında 1 saat boyunca inkübatörde önceden inkübe edin, Bu, paketlenmiş bir plakanın hücre kültürü koşullarına alıştırılması için gereklidir.
9. Düşük serum ortamı ile muamele edilmiş hücrelerin toplanması için, kültür kaplarında büyüyen hücreleri 1x PBS ile yıkayın ve 2 mL% 0.05 tripsin-EDTA (etilendiamintetraasetik asit) ekleyin. İnkübatöre 30 saniye yerleştirin ve tripsin-EDTA'yı çıkarın. düşük serum ortamındaki hücreleri 15 mL'lik bir tüpe toplayın ve hücreleri sayın elde taşınan otomatik hücre sayacı kullanarak.
10. Saydıktan sonra, hücreleri 100 x g'de 5 dakika santrifüjleyin ve süpernatanı atın.
11. Migrasyon ve invazyon tahlilleri için 800 μL düşük serum ortamında 800.000 hücreyi yeniden süspanse edin. Ek olarak, Crk ve CrkL'nin düzenlenmiş yıkımını doğrulamak için Western blot analizi için 2 mL kültür ortamında 300.000 hücreyi ve 35 mm'lik bir tabakta tohumu yeniden süspanse edin.

2. Temel okuma, hücrelerin tohumlanması, ve Hücre Empedansı Ölçümü ve Görselleştirme

1. Beşik Başlat düğmesine tıklayarak temel okumayı ölçün. Taban çizgisi, plakaların gerçek zamanlı hücre analiz sisteminin beşiğinde 1 saat boyunca ön inkübe edilmesinden sonra, karbondioksit inkübatöründeki kültür koşulları altında ve hücrelerin üst odadaki ilgili kuyucuklara tohumlanmasından önce okunmalıdır.
   NOT: Beşik Başlat butonuna tıklandığında kontrol ünitesi deney dosyasının kaydedilip kaydedilmeyeceğini soracaktır. Dosya kaydedildikten sonra, beşik analizörü başlangıçta programda ayarlandığı gibi temel hücre empedansını ölçer ve ikinci adımda hücre empedansını ölçmek için beşik Başlat düğmesine tekrar tıklanana kadar bir duraklama moduna girer.
2. Temel ölçümden sonra her iki plakayı da beşiklerden migrasyon ve istila için çıkarın ve biyogüvenlik kabininde saklayın.
3. 100 μL hücreyi (100.000 hücre) her biyolojik durum için dörtlü olarak tohumlayın CIM plakasının üst odasında, hava kabarcıklarını önlemek için ters pipetleme ile beşiğin kontrol ünitesinde programlandığı gibi ilgili kuyucuklarda.
4. Tohumlamadan sonra, hücrelerin eşit şekilde dibe çökmesini sağlamak için plakayı oda sıcaklığında 30 dakika boyunca bir biyogüvenlik kabininin altında tutun. Plakayı ilgili kızağa geri aktarın ve 1.5'in ikinci adımında programlandığı gibi hücre empedansını ölçmeye başlamak için kızak başlatma düğmesine tıklayın.
5. Son taramadan sonra deney tamamlanır ve sonuçlar otomatik olarak kaydedilir.
6. Veri Analizi sekmesi altında, deneyin tamamlanması sırasında veya sonrasında hücre empedansındaki değişiklikleri zamana bağlı bir şekilde hücre indeksi olarak görselleştirin. Dörtlü matrislerin ilgili koşullarının her biri, ortalama ve standart sapma için Seçenekler kutularına tıklanarak ayrı ayrı veya ortalamalar ve/veya standart sapmalar olarak görselleştirilebilir.
7. Hücre dizini verilerini bir elektronik tablo dosyasına aktarmak için boş bir elektronik tablo dosyası açın, imleci Veri Analizi penceresinin ortasına getirin ve sağ tıklayın. Görüntülenen iletişim kutusunda, Verileri Liste Biçimine Kopyala seçeneğini belirleyin ve verileri açık elektronik tabloya yapıştırın.
8. Ham verilerdeki zamanı, hücre empedansı ölçümünün gerçek başlangıç zamanını temsil edecek şekilde ayarlayın. İkinci adımın başlama zamanı sıfır olarak ayarlanmıştır.
   NOT: Kontrol ünitesi, hücre indeksini normalizasyonlu veya normalizasyonsuz (yani normalleştirilmiş hücre indeksi) elde etme ve sonuçları zamana bağlı bir şekilde grafiksel bir sunum olarak görselleştirme seçeneğine sahiptir. Bu örnekte, hücre dizini verileri, işleme ve grafik sunumu için normalleştirme olmadan dışa aktarılır.
9. Her yuvada Release düğmesine tıklayarak denemeyi serbest bırakın.

Malzemeler

Bu makalede kullanılan malzemelerin listesi

Ad	Şirket	Katalog numarası	Yorumlar
Biosafety cabinet	ThermoFisher Scientific	1300 Serisi Sınıf II, Type A2
CIM plates	Cell Analysis Division of Agilent Technologies, Inc	5665825001	Cell invasion and migration plates
Dulbecco'nun modifiye kartal ortamı (DMEM)	ATCC	302002	Hücre için kullanılan kültür ortamı kültür
Dulbecco'nun fosfat tamponlu tuzlu su (DPBS)	Gibco	21-031-CV	DPBS used to wash the cells
Fetal sığır serumu (FBS)	Hyclone	SH30910.03
Heracell VIOS 160i karbondioksit inkübatörü	ThermoFisher Scientific	51030285	Karbondioksit inkübatörü
Matrigel	BD Bioscience	354234	Extracellular matrix jel
RTCA software	Agilent Technologies, Inc<
Scepter	Millipore	C85360	Handheld automated cell counter
Trypsin-EDTA	Gibco	25300-054
U-118MG	ATCC	ATCC HTB15	Cell lines used for experiments
xCELLigence RTCA DP	Cell Analysis Division of Agilent Technologies, Inc	380601050

td style='width:145pt;'> <td style='width:147pt;'>Deney için kullanılan alet