Translaminar Otonom Sistem Kullanarak Translaminar Basınç Modeli Geliştirme

Abstract

Kaynak: Sharma, T. P., et al., İnsan Donör Arka Segmentlerinde Göz İçi ve İntrakraniyal Basıncın Modülasyonu için Translaminar Otonom Sistem Modeli. J. Vis. Uzm. (2020).

Bu video, translaminar otonom bir sistemde göz içi ve kafa içi basınçları simüle ederek translaminar basıncın retinal ganglion hücre sinyali üzerindeki etkilerini incelemek için bir insan gözünün hazırlanması prosedürünü göstermektedir.

Protocol

Numune toplama ile ilgili tüm prosedürler enstitünün IRB yönergelerine uygun olarak gerçekleştirilmiştir.

1. Ekipman ve malzemelerin hazırlanması ve sterilizasyonu

1. Gerekli malzemelerin tam listesinin yanı sıra tedarikçi ve katalog numaraları için Malzeme Tablosuna bakın.
2. Kullanmadan önce tüm ekipman ve aletleri otoklavlayarak veya etilen oksit ampulleri kullanarak sterilize edin.

2. Perfüzyon ortamının hazırlanması

1. % 1 penisilin-streptomisin (10.000 U / mL penisilin,% 0.85 NaCl içinde 10.000 μg / mL streptomisin) ve% 1 L-glutamin (200 mM) 1.000 mL yüksek glikoz Dulbecco'nun modifiye Eagle's besiyerine (DMEM) ekleyin.
2. Perfüzyon ortamını 0.22 μm'lik bir filtreden geçirerek sterilize edin.

3. Translaminar otonom sistem (TAS) kurulumu

1. Giriş şırıngalarını ayarlayın (göz içi basıncı (GİB) ve kafa içi basınç (ICP) rezervuarları).
   1. 30 mL'lik bir şırıngaya 30 mL perfüzyon ortamı (bölüm 2) ekleyin. 30 mL şırıngaya 3 yollu bir musluk takın. 3 yollu vanaya 0,22 μm hidrofilik filtre takın. 15 μm hidrofilik filtreye 0.22 G Luer saplama adaptörü takın.
   2. Şırınga kurulumundan hava kabarcıklarını çıkarın. Hortumu 15 G Luer saplama adaptörüne takın. Musluğun yan portunu havalandırılmamış evrensel bir kilit kapağıyla kapatın. Toplam iki kurulum için tekrarlayın.
   3. Bir şırıngayı kanal 1 intrakraniyal basınç (CH1 ICP) ve diğer şırıngayı kanal 2 göz içi basıncı (CH2 IOP) olarak etiketleyin.
2. Çıkış şırıngalarını ayarlayın (IOP ve ICP rezervuarları).
   1. 30 mL'lik bir şırıngaya 3 yollu bir musluk takın. 15 yollu musluğa 3 G Luer saplama adaptörü takın. Hortumu 15 G Luer saplama adaptörüne takın.
   2. Musluğun yan portunu havalandırılmamış evrensel bir kilit kapağıyla kapatın. Toplam iki kurulum için tekrarlayın. Bir şırıngayı CH1 ICP ve diğer şırıngayı CH2 GİB olarak etiketleyin.

4. İnsan tüm göz küresinin hazırlanması

NOT: Tüm gözler alınırsa, ön segmenti gözün arka segmentinden ayırmak için aşağıdaki prosedürü izleyin. Gözler ikiye bölünmüş olarak alınırsa, adım 4.4'ten başlayın.

1. Bütün bir gözü 2 dakika boyunca povidon-iyot çözeltisine yerleştirin.
2. Povidon-iyotu çıkarmak için gözü steril bir fosfat tamponlu çözeltide (PBS) durulayın. İki kez tekrarlayın.
3. Forseps ve makas kullanarak adnexa'yı tüm göz küresinden çıkarın. Gözün ön ve arka segmentlerini ayırmak için gözü ekvatorda ikiye bölün.
4. Optik sinir kılıfını çıkarın. Vitreus mizahını arka segmentten çıkarın.
5. Gerekirse, GİB (alt) odasının yuvarlak kubbesine iyi bir şekilde oturmasını sağlamak için arka segmentten ek sklera kesin. Forseps kullanarak, retinanın segmentin arkasına eşit şekilde yayıldığından emin olun.
6. GİB (alt) oda kurulumu
   1. İnsan arka segmentini, optik sinir üste bakacak şekilde yuvarlak kubbe üzerinden TAS'ın GİB (alt) odasına yerleştirin.
   2. Epoksi reçine O-ringini kullanarak dört vidayla arka segmenti kapatın ve sıkı bir sızdırmazlık sağlayın.
   3. Hortumu IOP (alt) odasının GİRİŞ ve ÇIKIŞ bağlantı noktalarına yerleştirin. Ortam içeren borulu GİB giriş şırıngası GİRİŞ portuna yerleştirilir ve borulu boş GİB çıkış şırıngası ÇIKIŞ portuna yerleştirilir.
   4. Arka göz kabını doldurmak için perfüzyon ortamını giriş portuna yavaşça infüze etmek için itme/çekme yöntemini kullanın ve aynı anda hatlardaki hava kabarcıklarını gidermek için perfüzyon ortamını çıkış şırıngasından yavaşça dışarı çekin. Hem GİRİŞ hem de ÇIKIŞ tüplerinde hava kabarcıkları kalmadığında ortamı demlemeyi bırakın.
   5. Muslukları kapalı konumda kilitleyin. 30 mL'lik şırıngayı IOP IN port filtre tertibatından çıkarın ve 30 mL ortamla doldurun. Ardından, şırıngayı filtre tertibatıyla değiştirin.
7. ICP (üst) bölme kurulumu
   1. ICP (üst) bölmesini/kapağını arka segmentin arkasına yerleştirin. Optik sinirin üst odacıkta olduğundan emin olun. Üst hazneyi dört vidayla kapatın.
   2. Hortumu ICP (üst) bölmesinin GİRİŞ ve ÇIKIŞ bağlantı noktalarına yerleştirin. Ortam içeren borulu ICP giriş şırıngası IN portuna yerleştirilir ve tüplü boş ICP çıkış şırıngası OUT portuna yerleştirilir.
   3. ICP haznesini doldurmak ve itme/çekme yöntemini kullanarak hatlardaki hava kabarcıklarını çıkarmak için ortamı IN portuna nazikçe ve yavaşça infüz edin. ICP odası ve hem GİRİŞ hem de ÇIKIŞ borularında hava kabarcıkları olmadığında ortamı demlemeyi bırakın.
   4. Muslukları kapalı konumda kilitleyin. 30 mL'lik şırıngayı ICP'deki port filtre tertibatından çıkarın ve 30 mL ortamla doldurun. Ardından, şırıngayı filtre tertibatıyla değiştirin.

Materials