Translaminar Otonom Sistem Kullanarak Translaminar Basınç Modeli Geliştirme

Özet

Kaynak: Sharma, T. P., et al., İnsan Donör Arka Segmentlerinde Göz İçi ve İntrakraniyal Basıncın Modülasyonu için Translaminar Otonom Sistem Modeli. J. Vis. Uzm. (2020).

Bu video, translaminar otonom bir sistemde göz içi ve kafa içi basınçları simüle ederek translaminar basıncın retinal ganglion hücre sinyali üzerindeki etkilerini incelemek için bir insan gözünün hazırlanması prosedürünü göstermektedir.

Protokol

Numune toplama ile ilgili tüm prosedürler enstitünün IRB yönergelerine uygun olarak gerçekleştirilmiştir.

1. Ekipman ve malzemelerin hazırlanması ve sterilizasyonu

1. Gerekli malzemelerin tam listesinin yanı sıra tedarikçi ve katalog numaraları için Malzeme Tablosuna bakın.
2. Kullanmadan önce tüm ekipman ve aletleri otoklavlayarak veya etilen oksit ampulleri kullanarak sterilize edin.

2. Perfüzyon ortamının hazırlanması

1. % 1 penisilin-streptomisin (10.000 U / mL penisilin,% 0.85 NaCl içinde 10.000 μg / mL streptomisin) ve% 1 L-glutamin (200 mM) 1.000 mL yüksek glikoz Dulbecco'nun modifiye Eagle's besiyerine (DMEM) ekleyin.
2. Perfüzyon ortamını 0.22 μm'lik bir filtreden geçirerek sterilize edin.

3. Translaminar otonom sistem (TAS) kurulumu

1. Giriş şırıngalarını ayarlayın (göz içi basıncı (GİB) ve kafa içi basınç (ICP) rezervuarları).
   1. 30 mL'lik bir şırıngaya 30 mL perfüzyon ortamı (bölüm 2) ekleyin. 30 mL şırıngaya 3 yollu bir musluk takın. 3 yollu vanaya 0,22 μm hidrofilik filtre takın. 15 μm hidrofilik filtreye 0.22 G Luer saplama adaptörü takın.
   2. Şırınga kurulumundan hava kabarcıklarını çıkarın. Hortumu 15 G Luer saplama adaptörüne takın. Musluğun yan portunu havalandırılmamış evrensel bir kilit kapağıyla kapatın. Toplam iki kurulum için tekrarlayın.
   3. Bir şırıngayı kanal 1 intrakraniyal basınç (CH1 ICP) ve diğer şırıngayı kanal 2 göz içi basıncı (CH2 IOP) olarak etiketleyin.
2. Çıkış şırıngalarını ayarlayın (IOP ve ICP rezervuarları).
   1. 30 mL'lik bir şırıngaya 3 yollu bir musluk takın. 15 yollu musluğa 3 G Luer saplama adaptörü takın. Hortumu 15 G Luer saplama adaptörüne takın.
   2. Musluğun yan portunu havalandırılmamış evrensel bir kilit kapağıyla kapatın. Toplam iki kurulum için tekrarlayın. Bir şırıngayı CH1 ICP ve diğer şırıngayı CH2 GİB olarak etiketleyin.

4. İnsan tüm göz küresinin hazırlanması

NOT: Tüm gözler alınırsa, ön segmenti gözün arka segmentinden ayırmak için aşağıdaki prosedürü izleyin. Gözler ikiye bölünmüş olarak alınırsa, adım 4.4'ten başlayın.

1. Bütün bir gözü 2 dakika boyunca povidon-iyot çözeltisine yerleştirin.
2. Povidon-iyotu çıkarmak için gözü steril bir fosfat tamponlu çözeltide (PBS) durulayın. İki kez tekrarlayın.
3. Forseps ve makas kullanarak adnexa'yı tüm göz küresinden çıkarın. Gözün ön ve arka segmentlerini ayırmak için gözü ekvatorda ikiye bölün.
4. Optik sinir kılıfını çıkarın. Vitreus mizahını arka segmentten çıkarın.
5. Gerekirse, GİB (alt) odasının yuvarlak kubbesine iyi bir şekilde oturmasını sağlamak için arka segmentten ek sklera kesin. Forseps kullanarak, retinanın segmentin arkasına eşit şekilde yayıldığından emin olun.
6. GİB (alt) oda kurulumu
   1. İnsan arka segmentini, optik sinir üste bakacak şekilde yuvarlak kubbe üzerinden TAS'ın GİB (alt) odasına yerleştirin.
   2. Epoksi reçine O-ringini kullanarak dört vidayla arka segmenti kapatın ve sıkı bir sızdırmazlık sağlayın.
   3. Hortumu IOP (alt) odasının GİRİŞ ve ÇIKIŞ bağlantı noktalarına yerleştirin. Ortam içeren borulu GİB giriş şırıngası GİRİŞ portuna yerleştirilir ve borulu boş GİB çıkış şırıngası ÇIKIŞ portuna yerleştirilir.
   4. Arka göz kabını doldurmak için perfüzyon ortamını giriş portuna yavaşça infüze etmek için itme/çekme yöntemini kullanın ve aynı anda hatlardaki hava kabarcıklarını gidermek için perfüzyon ortamını çıkış şırıngasından yavaşça dışarı çekin. Hem GİRİŞ hem de ÇIKIŞ tüplerinde hava kabarcıkları kalmadığında ortamı demlemeyi bırakın.
   5. Muslukları kapalı konumda kilitleyin. 30 mL'lik şırıngayı IOP IN port filtre tertibatından çıkarın ve 30 mL ortamla doldurun. Ardından, şırıngayı filtre tertibatıyla değiştirin.
7. ICP (üst) bölme kurulumu
   1. ICP (üst) bölmesini/kapağını arka segmentin arkasına yerleştirin. Optik sinirin üst odacıkta olduğundan emin olun. Üst hazneyi dört vidayla kapatın.
   2. Hortumu ICP (üst) bölmesinin GİRİŞ ve ÇIKIŞ bağlantı noktalarına yerleştirin. Ortam içeren borulu ICP giriş şırıngası IN portuna yerleştirilir ve tüplü boş ICP çıkış şırıngası OUT portuna yerleştirilir.
   3. ICP haznesini doldurmak ve itme/çekme yöntemini kullanarak hatlardaki hava kabarcıklarını çıkarmak için ortamı IN portuna nazikçe ve yavaşça infüz edin. ICP odası ve hem GİRİŞ hem de ÇIKIŞ borularında hava kabarcıkları olmadığında ortamı demlemeyi bırakın.
   4. Muslukları kapalı konumda kilitleyin. 30 mL'lik şırıngayı ICP'deki port filtre tertibatından çıkarın ve 30 mL ortamla doldurun. Ardından, şırıngayı filtre tertibatıyla değiştirin.

Malzemeler

Bu makalede kullanılan malzemelerin listesi

Ad	Şirket	Katalog numarası	Yorumlar
#122, 1-1/8" İç x 1-5/16" Dış Çap, Viton O-Ring, 3/32" Kalın, 755 Durometer 50 Pack	Amazon	B07DRGPPZJ
114 Buna-N O-Ring, 70A Durometre, Siyah, 5/8" ID, 13/16" OD, 3/32" Genişlik (100'lük Paket)	Amazon	B000FMYRHK
30 mL İğnesiz Şırıngalar	Vitality Medical	302832
3 Yollu Musluk, 2 Dişi Luer Kilidi, Döner Erkek Luer Kilidi, Bacalı Kapak	QOSINA	2C6201
4-40 X 1/2 PH PAN MS SS/CHROME ve uygun boyutta phillips tornavida	Brikksen Paslanmaz Çelik Bağlantı Elemanları	PPMSSSCH4C.5
ANPROLENE 16 LARGE AMPULE	Fisher Scientific	NC9085343
Betadine	Purdue	PUR1815001EACH
Corning 100 x 20mm doku kültürü ile tedavi edildi Kültür Yemekleri	Sigma-Aldrich	CLS430167-100EA
Corning L-glutamin Solution	Fisher Scientific	MT25005CI
Covidien 3033 Curity Gazlı Bez Sünger, 4" x 4", 12 Katlı, Steril, 1200/CS	Med Plus Medical Supply	COV-3033-CS
Pansuman Forseps Narin Kavisli (tırtıklı)	Katena	K5-4010
Dumont #5 - Fine Forceps	F.S.T.	11254-20
Eye Scissors Standard Curved	Katena	K4-7410
Falcon 150 x 15mm Düz Steril Tek Kullanımlık Petri Kapları	Capitol Scientific	351058
Fisherbrand 4 oz. Numune Kapları	Fisher Scientific	16-320-730
Fisherbrand Anında Mühürleme Sterilizasyon Torbaları	Fisher Scientific	01-812-54
Fisherbrand Anında Sızdırmazlık Sterilizasyon Torbaları	Fisher Scientific	01-812-55
Fisherbrand Anında Sızdırmazlık Sterilizasyon Torbaları	Fisher Scientific	01-812-58
HyClone Dulbecco'nun Modifiye Edilmiş Kartalları Orta	Fisher Scientific	SH3024302
HyClone Penicillin Streptomycin 100X Solution	Fisher Scientific	SV30010
Dişi Luer Kilit Girişli Hidrofilik Filtre, Erkek Luer Kayma Çıkışı, Mavi ve Açık	Qosina	28217
Hidrostatik basınç transdüserleri, DELTRAN ® II, Katalog # DPT-200, 3CC/HR akış hızına sahip	AD instruments	DPT-200
JG15-0.5HPX 15 Ölçer 0.5" NT Premium Serisi Dağıtım Ucu 50/Box	Jenson Global	JG15-0.5HPX 15
Keyence B2‐X710 mikroskop	Keyence	B2-X710
LabChart 8	AD instruments	LabChart 8
Leica ST5020 Multi-stainer	Leica	ST5020
Havalandırmasız Universal Luer Lock Cap, Beyaz	QOSINA	65811
Octal Bridge Amp (Model # FE228)	AD instruments	FE228
Pharmco Products ETHYL ALCOHOL, 200 PROOF	Fisher Scientific	NC1675398
Phosphate Buffered Solution (PBS)	Sigma-Aldrich	D8537-500ML
PowerLab 8/35 (Model # PL3508)	AD instruments	PL3508
ProLong Altın Antifade Mountant with DAPI	ThermoFisher	P36935
Hava ve Su için Bas-Bağla Boru Bağlantısı, 1/8" Tüp OD x 1/8 NPT Erkek	McMAster-Carr	7880T113
Hava ve Su için Üniversal Dişli Bas-Bağla Boru Bağlantısı, Adaptör, 1/8" Tüp OD x 1/8 Boru	McMAster-Carr	51235K101
Saint-Gobain Tygon S3 E-3603 Esnek Boru 500 ft.	Fisher Scientific	14-171-268
Superblock T20	Fisher Scientific	PI37536
Surgical Scissors - Sharp-Blunt<	14001-14
Doku Forseps Hassas 1x2 Diş Kavisli	Katena	K5-4110
Translaminar Otonom Sistem (TAS)	Kuzey Teksas Üniversitesi Sağlık Bilimleri Merkezi	N/A<
USA Boyut 030 O-ring Buna-N, B1000, 70 Durometre, Siyah, Buna-N (NBR, Nitril, Buna)	Marco Rubber & Plastics	B1000-030

td style='width:174pt;'>F.S.T.td style='width:174pt;'>