İnsan Sinaptozomları Kullanılarak Mikroglia Benzeri Hücrelerin Canlı Hücre Fagositoz Testi

Özet

Kaynak: Funes, S., et. al., İnsan Mikroglia Benzeri Hücreler: İnsan Sinaptozomları Kullanılarak İndüklenmiş Pluripotent Kök Hücrelerden ve İn Vitro Canlı Hücre Fagositoz Testinden Farklılaşma. J. Vis. Uzm. (2022)

Bu video, pH'a duyarlı floresan boya etiketli sinaptozomlar kullanarak mikroglia benzeri hücrelerin fagositik kapasitesini incelemek için bir testi göstermektedir.

Protokol

1. Canlı hücre fagositoz testi
   1. Plate 20-30 × 10⁴ PMP'yi 100 μL iMG tam ortamda 96 oyuklu plakalara yerleştirin ve 10 gün boyunca farklılaşma sürecini takip edin.
   2. Tahlil gününde, canlı hücreler için 1 damla nükleer leke ekleyerek nükleer boyama solüsyonunu 2 mL iMG bazal ortama hazırlayın.
   3. 96 oyuklu plakanın oyuğu başına 40 μL ortamı çıkarın ve çok kanallı bir pipet kullanarak 10 μL nükleer boyama solüsyonu ekleyin. Plakayı 37 ° C'de ve% 5 CO_2'de 2 saat inkübe edin.
   4. Etiketli sinaptozomları buz üzerinde çözün ve 1 dakika boyunca bir su sonikatörü kullanarak nazikçe sonikasyon yapın. Sinaptozomları hemen tekrar buza aktarın. Etiketli sinaptozomları, ortamın 50 μL'si başına 1 μL sinaptozom oranında iMG tam ortamda seyreltin.
      NOT: Sinaptozom konsantrasyonu teste bağlıdır ve optimizasyon gerektirebilir. Ortamda nispeten düşük bir DMSO yüzdesini (yani, %0.1 veya daha az) korumak için, kuyu başına 2 μL'den fazla sinaptozom eklenmemesi tavsiye edilir.
   5. Negatif bir kontrol olarak, aktin polimerizasyonunu ve dolayısıyla fagositozu inhibe etmek için bazı kuyucukları sitokalasin D ile ön işlemden geçirin. iMG tam ortamında 60 μM sitokalasin D çözeltisi hazırlayın. 10 μM'lik bir nihai konsantrasyon için her bir oyuğa bu çözeltiden 10 μL ekleyin ve 37 ° C ve% 5 CO_2'de 30 dakika inkübe edin.
   6. Plakayı inkübatörden çıkarın ve 10 °C'de 10 dakika inkübe edin. Plakayı buz üzerinde tutun ve 50 μL orta sinaptozom ekleyin.
   7. Plakayı 270 × g'da 10 °C'de 3 dakika santrifüjleyin ve görüntüleme elde edilene kadar plakayı buz üzerinde tutun.
2. Imaging acquisition and analysis
   1. Plakayı canlı hücreli bir görüntüleme okuyucusuna yerleştirin ve analiz edilecek kuyucukları seçin.
   2. 20x objektif lens seçin.
   3. Brightfield ve Blue (4',6-diamidino-2-fenilindol [DAPI]) kanallarının odağını, ışık yayan diyot (LED) yoğunluğunu, entegrasyon süresini ve kazancını ayarlayın. Sinaptozom floresansı, ilk zaman noktasında ihmal edilebilir olmalıdır. Kırmızı (RFP) kanala odaklanmak için parlak alan kanalını referans olarak kullanın. Entegrasyon süresi ve kazancı deneyler arasında değişebilir; kırmızı kanal için şu başlangıç ayarlarını kullanın: LED: 4, entegrasyon süresi: 250 ve kazanç: 5.
   4. Kuyu başına bir montajda elde edilecek tek tek karo sayısını seçin (örneğin, kuyunun merkezinde 16 karo elde edin, böylece toplam kuyu alanının yaklaşık %5'ini görüntüleyin). Sıcaklığı 37 °C'ye ve görüntüleme için istenen zaman aralığına ayarlayın.
      NOT: Bu çalışmada görüntüler 16 saate kadar her 1 - 2 saatte bir alınmıştır.

Malzemeler

Bu makalede kullanılan malzemelerin listesi

Ad	Şirket	Katalog numarası	Yorumlar
Cell culture materials
Primaria 96-well Clear Flat Bottom Microplate	Corning	353872
CellStick Laminin-521	STEMCELL Technology	77004	Laminin 521
Components of iMG base media
Advanced DMEM/F12	Gibco	12634010	Son konsantrasyon 1x
GlutaMAX	Gibco	35050061	Son konsantrasyon 1x
N2 supplement, 100x	Gibco	17502-048	Son konsantrasyon 1x
Penisilin-Streptomisin (10.000 U/mL)	Gibco	15140122	Son konsantrasyon 100 U/mL
Components of iMG complete media
55 mM 2-merkaptoetanol	Gibco	21985023	Son konsantrasyon 55 μM
IL-34	PeproTech veya Biologend	200-34 or 577904	Son konsantrasyon 100 ng/mL
iMG base media			Son konsantrasyon 1x
M-CSF	PeproTech	300-25	Son konsantrasyon 5 ng/mL
TGF-β	PeproTech	100-21	Son konsantrasyon 50 ng/mL
Fagositoz tahlil boyaları
NucBlue Live Ready reagent	Invitrogen	R37605
pHrodo Red, süksinimidil ester	ThermoFisher Scientific	P36600	pH'a duyarlı boya
Diğer hücre kültürü reaktifleri
Cytochalasin D	Sigma		Son konsantrasyon 10 μM
Yazılım ve Ekipman
Centrifuge	Eppendorf	Model 5810R
Cytation 5 canlı hücre görüntüleme okuyucusu	Biotek
Gen5 Mikroplaka Okuyucu ve Görüntüleyici Yazılımı	Biotek	version 3.03

olarak anılır