Fosforile Nöronal Potasyum-Klorür Kotransporter 2'nin Western Blotting ile Tespiti

Özet

Kaynak: Josiah, S. S., ve diğerleri. Western Blotting Kullanılarak Nöronal K-Cl Ko-Taşıyıcı KCC2'nin İşlevleri ve Aktivitelerinin İncelenmesi. J. Vis. Uzm. (2022).

Video, bir hücre lizatında fosforile potasyum-klorür kotransporter 2 (KCC2) proteinini tespit etme ve miktarını belirleme adımlarını göstermektedir. Bu işlem, fosforile edilmiş KCC2'yi izole etmek için immünopresipitasyonu ve izole edilen proteini ölçmek için kemilüminesansı içerir.

Protokol

1. Hücre kültürü ve transfeksiyon

1. Hücre kültürü işleminden önce tüm reaktifleri boncuk banyosunda (37 °C) ısıtın. % 10 fetal sığır serumu,% 1 2mM L-glutamin, 100x esansiyel olmayan amino asit, 100 mM sodyum piruvat ve 100 birim / mL penisilin-streptomisin ile desteklenmiş Dulbecco'nun Modifiye Eagle Medium'u (DMEM) kültür ortamını hazırlayın.
2. Stabil bir şekilde transfekte edilmiş sıçan KCC2b insan embriyonik böbrek 293 hücresini (HEK293^rnKCC2b) tamamen boncuk banyosunda (37 °C) çözün. Hücreleri kriyoviyal tüpten 5 mL taze ortam içeren bir santrifüj tüpüne aktarın. Hücreyi 3-5 dakika boyunca 1200 ×g'da döndürün.
3. Süpernatanı aspire etmek için bir aspiratör pipeti (bir vakum pompasına sabitlenmiş) kullanın ve hücreleri yeniden süspanse etmek için 10 mL taze ortam ekleyin. Hücre süspansiyonunu 10 cm'lik bir tabak plakasına aktarın.
4. Çanağı kuluçka makinesine yerleştirin ve nemlendirilmiş% 5 CO₂ atmosferde 37 ° C'de 48 saat büyümesine izin verin. Sağlıklı hücre büyümesini sağlamak için kuluçka dönemini izleyin. Kuluçka döneminden sonra% 90'ın üzerinde birleşme elde ettiklerinde hücreleri daha da bölün.
5. Eski ortamı hücre kabından aspire edin ve hücreleri 2 mL fosfat tampon salin (PBS) ile nazikçe durulayın. 2 mL tripsin ekleyin ve oda sıcaklığında yaklaşık 1-2 dakika inkübe edin.
6. Tabaktaki tripsinizli hücreleri nazikçe yıkamak için 2 mL tam ortam kullanın. Yeni yemeklere 9 mL taze ortam ekleyin ve eski yemekten yenilerinin her birine 1 mL çözelti ekleyin. % 90'lık ≥ birleşme elde etmek için bölünmüş hücre kaplarını 48 saat boyunca inkübatöre geri aktarın.
7. Hücreleri lizis tamponunda toplamadan önce 15 dakika boyunca kontrol olarak dimetil sülfoksit (DMSO), 8 μM staurosporin veya 0.5 mM N-etilmaleimid (NEM) ile tedavi edin.

2. Hücre lizatlarının hazırlanması ve örneklerin yüklenmesi

1. Kültür kabı üzerindeki ortamı aspire edin (transfeksiyon prosedürlerinden). Hücre kültürünü buzun üzerine yerleştirin ve hücreleri buz gibi soğuk PBS ile yıkayın.
2. PBS'yi aspire edin, ardından 50 mM tris-HCl (pH 7.5), 1 mM etilen glikol-bis (β-aminoetil eter) -N, N, N', N', N'-tetraasetik asit (EGTA), 1 mM etilendiamintetraasetik asit (EDTA), 50 mM sodyum florür, 5 mM sodyum pirofosfat, 10 mM sodyum-β-gliserofosfat, 1 mM sodyum ortovanadat, %1 (a/h) Triton X-100, Tabağa 0.27 M sükroz, 1 mM benzamin, %0.1 (h/h) 2-merkaptoetanol ve 2 mM fenilmetilsülfonilflorür (PMSF).
   NOT: Hücre hasadı sırasında lizis tamponunun hacmi çanak boyutlarına göre değişir, örneğin, 1 x 10⁷ hücre/100 mm çanak/150 cm² şişe başına 1 mL uygundur, 5 x 10⁶ hücre/60 mm çanak/75 cm² şişe başına 1 mL uygundur.
3. Hücreleri tabağın dibinden sıyırmak için soğuk bir plastik hücre kazıyıcı kullanın, ardından hücre süspansiyonunu zaten buz üzerinde olan bir mikro santrifüj tüpüne aktarmak için nazikçe bir pipet kullanın. Tüpü 4 °C'de 30 dakika boyunca sürekli çalkalayın.
4. } Hücre lizatlarını soğuk bir santrifüjde (4 °C) 16.000 x g sıcaklıkta 20 dakika döndürün, tüpü santrifüjden nazikçe çıkarın ve buzun üzerine yerleştirin. Süpernatanı önceden soğutulmuş taze bir tüpe toplayın ve peleti atın.
   NOT: Hücre tipine bağlı olarak santrifüjleme kuvvetini ve süresini değiştirmek gerekebilir. Yine de, genel yönergeler 20 dakika boyunca 16.000 x g'de santrifüjlemeyi teşvik eder. Ancak, bu her deney için belirlenmelidir. Örneğin, lökositler gibi hassas hücreler çok hafif bir santrifüj hızına ihtiyaç duyar.

3. Hücre lizatlarından immünopresipitantların hazırlanması

1. 300 μL protein-G-sefarozu bir mikrosantrifüj tüpüne pipetleyin. Çözeltiyi 500 x g'de 2 dakika döndürün ve süpernatanı atın.
2. 500 μL PBS ekleyin ve çözeltiyi iyice girdaplayın. Çözeltiyi 500 x g'de 2 dakika döndürün ve süpernatanı atın. Bu adımı tekrarlayın.
3. 1 mg anti-KCC2 Thr906 ve anti-KCC2 Thr1007 antikorlarını 200 μL protein G-sefaroz boncukları ile karıştırın ve PBS ile hacmi 500 μL'ye kadar tamamlayın. Titreşimli bir platform veya dönen tekerlek üzerinde 4 °C'de 2 saat sallayın. PBS ile 2 kez yıkayın.
4. Tüm hücre lizatları üzerinde protein miktar tayini yapın ve yıkanmış boncuklara 1 mg hücre lisatı ekleyin. Uçtan uca bir döndürücüde 4 ° C'de 2 saat boyunca nazikçe inkübe edin. Boncukları aşağı doğru döndürün ve 150 mM sodyum klorür (NaCl) içeren PBS ile 3 kez yıkayın.
5. İmmünopreçökelticanları (boncuklar) 3x 200 μL PBS ile yıkayın. Son peleti 100 μL 1x lityum dodesil sülfat (LDS) numune tamponunda yeniden süspanse edin.
6. Tüpleri oda sıcaklığında bir rotor çalkalayıcıda 5 dakika çalkalayın ve 75 °C'de bir ısıtma bloğunda 10 dakika inkübe edin. Yükleme örneğini 11.000 x g'de 2 dakika santrifüjleyin ve jel yüklemesi için süpernatanı kullanın.

4. Western blot'un yapılması

1. Döküm aparatını birleştirin ve taze hazırlanmış %8'lik ayırma jelini dökün (tarif/hazırlık için Tablo 1'e bakınız) ve döküm camın üstünden yaklaşık 2 cm boşluk bırakarak jeli dökün. Kuruluma 200 μL mutlak izopropanol ekleyin ve 60 dakika oda sıcaklığında bekletin.
   NOT: Sodyum dodesil sülfat-poliakrilamid jel elektroforezi (SDS-PAGE) için poliakrilamid jel tarifi, ilgilenilen proteinin boyutuna bağlıdır (Tablo 2). Bu nedenle, istenen jel yüzdesini belirlemeden önce protein boyutunu not edin.
2. İzopropanolü çıkarmak için bir pipet kullanın ve jeli yaklaşık 200 μL damıtılmış su ile dikkatlice durulayın. Döküm kurulumundaki yaklaşık 6 cm'lik boşluğu doldurmak için taze hazırlanmış %2 istifleme jeli ekleyin (tarif/hazırlık için Tablo 1'e bakın). Kuyu tarağına nazikçe yerleştirin ve oda sıcaklığında 30 dakika bekletin.
3. Döküm jeli elektroforez tankına sabitleyin.
4. 10x transfer tamponu hazırlamak için 30.3 g Tris bazı, 144.1 g glisin ve 10 g SDS'yi 1000 mL damıtılmış suda çözün. 890 mL damıtılmış suya 10 mL %10 SDS ve 100 mL 10x transfer tamponu ekleyerek 1x çalışma tamponu hazırlayın.
5. Tanka 1x çalışma tamponu dökün. İlk oyuğa 5 μL moleküler ağırlık işaretleyicisi ve SDS-PAGE jelinin her bir oyuğuna eşit miktarda protein yükleyin (kullanılan tarak boyutuna bağlı olarak 18-30 μL arasında). Boş kuyuları 1x LDS ile doldurun ve jeli 120 V'ta yaklaşık 90-120 dakika çalıştırın.
6. 10x transfer tamponu hazırlamak için 58.2 g Tris bazı ve 29.3 g glisini 1000 mL damıtılmış suda çözün. %20 metanol içeren 1x transfer tamponu ile nitroselüloz membranı aktive edin. Jeli ve zarı transfer tamponu ile durulayın ve nazikçe hazırlama yığınının üzerine yayın.
   NOT: Gereken optimum pH'da olmaları gerektiğinden, çalışma ve transfer tamponlarının pH'ını ayarlamaya gerek yoktur. Ayrıca, zaman kazanmak için bu tamponların hazırlanması ve deneyden önce oda sıcaklığında saklanması tavsiye edilir.
7. Aktarılacak sandviçi şu sırayla düzenleyin: negatif elektrot (siyah çerçeve/uç) - sandviç köpüğü - filtre kağıdı - durulanmış SDS-PAGE jel - durulanmış nitroselüloz membran - filtre kağıdı - sandviç köpük - pozitif elektrot (kırmızı çerçeve). Monte edilmiş sandviçi transfer tankına istifleyin ve 90 dakika boyunca 90 V'ta veya 360 dakika boyunca 30 V'ta çalıştırın.

5. Antikor boyama ve görüntü geliştirme

1. Membranı çıkarın ve kurumasını bekleyin. %0,1 1x Tween 20 (1x TBS-T) içeren Tris tamponlu tuzlu suda %5 yağsız sütten yapılmış bir bloke edici tampon kullanarak zarı oda sıcaklığında 1 saat bloke edin.
2. Membranları, uygun primer antikor dilüsyonları ^8,15,19 ve beta-aktin (yükleme kontrolü) ile oda sıcaklığında 1 saat veya gece boyunca 4 °C'de bloke edici tamponda inkübe edin. Membranı, her biri 5 dakika boyunca 1x TBS-T'den üç yıkamada yıkayın.
   NOT: Ayrı zarın beta-aktin, alfa-tubulin veya gliseraldehit 3-fosfat dehidrojenaz antikorları gibi yükleme kontrolleri ile inkübe edilmesi, sonraki miktar tayini sırasında diğer batı lekeleme sonuçlarını normalleştirmek içindir. Her primer antikor için önerilen seyreltme, üretici kılavuzunda mevcuttur.
3. Yıkanmış membranı, oda sıcaklığında 60 dakika boyunca bloke edici tamponda 5000 kat seyreltilmiş ikincil antikor ile inkübe edin. Yine, membranı 3x 1x TBS-T'de her biri 5 dakika boyunca yıkayın.
   NOT: İkincil antikorun, birincil antikorun yükseltildiği türe karşı yükseltilmesi şiddetle tavsiye edilir. Örneğin, toplam KCC2'nin birincil antikoru fare anti-KCC2 ise, o zaman anti-fare için ikincil antikor kullanılmalıdır.
4. Yıkanmış zarı görüntüleme kartına yerleştirin. Her bir gelişmiş kemilüminesans (ECL) reaktifinin eşit hacimlerini karıştırın ve sinyaller geliştirmek için karışık çözeltiyi zar üzerine nazikçe yayın.

6. Bir görüntüleme sistemi ve veri ölçümü kullanarak görüntü elde etme

1. Görüntüleme kartını görüntüleme için görüntüleme sistemindeki uygun bölmeye aktarın. Görüntü işleme için bilgisayardaki görüntüleme yazılımını açın.
2. Araç çubuğunda Yeni Protokol öğesine tıklayın ve Tek Kanal öğesini seçin. Jel görüntüleme/uygulama iletişim kutusu altında öğesini seçin öğesine tıklayın, Blot 'a gidin ve Chemi Hi Sensitivity veya Chemi Hi Resolution'ı seçin. Ardından, elde edilecek görüntülerin süresini ve sayısını ayarlamak için Sinyal Biriktirme Kurulumu üzerine tıklayın.
3. Protokol kurulumu altında Position Gel öğesine tıklayın ve gerekirse görüntüleme sistemindeki jeli ayarlayın. Görüntüleri almak için Protokolünü Çalıştır'a tıklayın.
4. Görüntüleri bilgisayara kaydetmek için görüntüleme kataloğu kutusunun altındaki alınan görüntülerden birine sağ tıklayın. İstediğiniz görüntüye gidin ve çalıştır iletişim kutusunun altında Görüntü Seç ve Devam Et seçeneğine tıklayın.
5. Görüntünün kontrastını ve piksel doygunluğunu ayarlamak için Görüntü Dönüşümü simgesine tıklayın. İstenen görüntü formatına bağlı olarak görüntüyü bilgisayara kaydetmek için genel araç çubuğundaki Screenshot simgesine tıklayın.
6. ImageJ yazılımını kullanarak bant yoğunluklarını ölçün ve uygun istatistiksel araçları kullanarak analiz edin.

Sonuçlar

Tablo 1: Poliakrilamid jel karışımı yapmak için tarif (jel çözeltilerini ayırma ve istifleme).

8 mL %8 ayırıcı jel

Malzemeler