$$\rightleftharpoonup{xx}$$
$$\longleftharp{xx}$$,
$$\longrightharp{xx}$$,
Hayvan örneklerini içeren tüm prosedürler, uygun hayvan etik inceleme komitesi tarafından gözden geçirilmiş ve onaylanmıştır.
1. Retinal ganglion hücrelerinin somalarının miktar tayini
NOT: Aşağıdaki prosedür, retinal düz montajların beyne özgü homeobox/POU alan proteini 3A'ya (Brn3a) karşı bir antikorla immünohistokimyasal boyanmasına dayanan RGC somalarının miktar tayini içindir.
- İzole retinaları 1 mL 1x PBS içeren 24 oyuklu bir kültür plakasına (oyuk başına bir retina) aktarın ve iç retinayı yukarı bakacak şekilde tutun.
- 1x PBS (0.3 mL) içinde seyreltilmiş iyonik olmayan bir yüzey aktif madde ile% 0.5 ile 3x'i 10 dakika yıkayarak dokuyu geçirgenleştirin. Daha sonra dokuyu oda sıcaklığında 60 dakika boyunca% 5 sığır serum albümini (BSA) iyonik olmayan yüzey aktif madde% 2 ve 1x PBS (bloke edici çözelti; 0.25 mL) içinde hafifçe çalkalayın.
- Adım 1.2 sırasında, iyonik olmayan yüzey aktif madde %0.5 ve 1x PBS artı %5 BSA içinde 1:200 seyrelterek Brn3a birincil antikor çözeltisini hazırlayın ve 4 °C'de saklayın.
- 60 dakikalık doku blokajından sonra, retinaları 0.2 mL birincil antikor çözeltisinde 4 ° C'de 72 saat boyunca hafifçe çalkalayarak inkübe edin.
- Dokuyu 3x 1x PBS ile 10 dakika boyunca yıkayın, daha sonra dokuyu oda sıcaklığında 2 saat boyunca 1x PBS ve% 5 BSA'da 1: 750 oranında seyreltilmiş 0.2 mL ikincil antikor çözeltisinde inkübe edin.
- Ayrıca, floresan çekirdek boyaması için dokuyu nükleer karşı leke çözeltisinde 10 dakika inkübe edin. İmmünohistokimyayı, 3 kez tekrarlanan 1x PBS (0.3 mL) ile son bir yıkama adımı ile sonlandırın.
- Retinaları iki küçük fırça yardımıyla, vitreus tarafı yukarı bakacak şekilde cam mikroskop slaytlarına aktarın. Dorsal retinal kadranı mikroskop slaytları üzerine yerleştirin. Diğer 3 kadranı (nazal, ventral ve temporal) sınırlamak için optik sinir kafasına doğru iki radyal kesim daha yapın.
NOT: Kesim boyutları sabit değildir. Slayt üzerinde retinanın etkili bir şekilde düzleşmesini bozacak kadar kısa olmamalı ve optik sinir foramenine ulaşacak ve sınırlı retinal kadranı dokunun geri kalanından tamamen ayıracak şekilde çok uzun olmamalıdır. - Son olarak, bir cam lamel üzerine 0.2 mL antifade montaj ortamı uygulayın ve bunu doku mikroskobik analizi için düz monte edilmiş retinaya yerleştirin. RGC'lerin yoğunluğunu tahmin etmek için, düz bağlantıları 40x/1.3 objektif kullanarak konfokal epifloresan mikroskobu altında inceleyin.
- Retinanın her çeyreği için sekiz fotoğraf çekin: ikisi merkezi retinadan (optik diskten ~ 0.9 mm), üçü orta retinadan (optik diskten ~ 2.0 mm) ve üçü periferik retinadan (optik diskten ~ 3.7 mm), retina başına toplam 32 fotoğraf. Brn3a-pozitif hücreleri saymak ve ortalama hücre yoğunluğunu tahmin etmek için FIJI yazılımını kullanın.