Bir Fare Modelinde Hafif Travmatik Beyin Hasarının İndüksiyonu

Özet

Kaynak: Macheda, T., et. al. Farelerde Hafif Travmatik Beyin Hasarının Elektromanyetik Kontrollü Kapalı Kafa Modeli. J. Vis. Uzm. (2022)

Bu video, stereotaksik çerçeve kullanan bir fare modelinde kapalı kafa yaralanmasına neden olma prosedürünü göstermektedir. Kontrollü etki, hafif travmatik beyin hasarını taklit ederek, araştırmacıların yaralanma sonrası refleksleri ve davranışları ölçerek nörolojik etkileri ve iyileşmeyi incelemelerine olanak tanır.

Protokol

Hayvan modellerini içeren tüm prosedürler, yerel kurumsal hayvan bakım komitesi ve JoVE veteriner inceleme kurulu tarafından gözden geçirilmiştir.

1. Cerrahi prosedür

1. Hafif asetal reçine konik uçlu kulak çubukları, bir ısırma çubuğu ve bir fare anestezi maskesi kullanarak fareyi stereotaksik çerçeveye sabitleyin (bkz. Şekil 1G, H). İzofluran gazı, oda havasında 100-200 mL/dk'da %2-%3 oranında verilir. Anestezi derinliğini sağlamak ve gaz seviyesini gerektiği gibi ayarlamak için farenin solunumunu dikkatlice izleyin.
2. Korneanın kurumasını önlemek için gözlere steril göz kayganlaştırıcı uygulayın.
3. Saç derisini povidon-iyot çubukları ve steril alkol pedleri ile üç kez sterilize edin.
4. Ayak parmağını kıstırma tepkisi olmadığını doğrulayarak farenin derinlemesine uyuşturulduğundan emin olun.
5. Bir neşter kullanarak gözler ve boyun arasında yaklaşık 1 cm'lik bir orta hat kafa derisi kesisi yapın ve kafatasını açığa çıkarın (bkz. Şekil 1I).
6. Kafatasının 1-2 dakika kurumasını bekleyin.
7. Bregma'yı (koronal ve sagital sütürlerin kesişme noktası) ve lambda'yı (sagital ve lambdoid sütürlerin kesişimi) tanımlayın (bkz. Şekil 1J).
   NOT: Referans olarak bir fare beyin atlası kullanılabilir.
8. Baş destek aparatını başın altına yerleştirin ve ampulü, farenin kafasının altına bastırana kadar suyla şişirin, ancak kafayı ısırma çubuğundan kaldırmayarak tutun.
   NOT: Bu adım, kapalı kafa travmasından (CHI) kaynaklanan olası kulak sorunlarını azaltmak için gereklidir. Kulak çubuklarından kulağa zarar veren, yuvarlanma veya kanama ile sonuçlanan herhangi bir hayvan çalışmadan çıkarılmalı ve ötenazi yapılmalıdır.
9. Çarpma tertibatını hayvanın başının üzerine yerleştirin.
10. Genişlet/Geri Çek/Geri Çek/Çıkar geçiş anahtarını (çarpma tertibatı kontrol kutusunda) Genişlet'e yerleştirerek çarpma tertibatını uzatın.
    NOT: Ucu aşağı çekerek ucun tamamen uzadığından emin olun.
11. Çarpma tertibatını bregma üzerinde ortalanana kadar hizalayın (bkz. Şekil 1K).
12. Stereotaksik okuyucudaki dijital stereotaksik x ve y koordinatlarını 0'a sıfırlayın (dokunmatik ekran kontrolünde)
13. Probu bregmadan hedef koordinatlara doğru hareket ettirerek probu çarpma konumu üzerinde hizalayın: medial-lateral = 0.0 mm, ön-arka = -1.6 mm.
14. Temas sensörünü hayvanın kulağına klipsleyin.
    1. Yüzeyle ilk temas sağlanana kadar prob ucunu uzatılmış probla yavaşça indirin. Bip sesinde durun.
    2. Stereotaksik okuyucudaki dijital stereotaksik z koordinatlarını 0'a sıfırlayın.
15. Ucun kafatası ile aynı hizada olup olmadığını dikkatlice inceleyin (medial-lateral ve ön-arka düzlemler).
    NOT: Prob ucunu konumlandırmak, kafatası kırıklarını ve kulak hasarını önlemek için bu işlemin en önemli adımıdır.
16. Kontrol kutusundaki geçiş anahtarını Geri Çekme konumuna getirerek çarpma tertibatını geri çekin. Uç geri çekilir ve çarpma anına kadar hayvanın kafasıyla daha fazla temas etmez.
17. Dorsal-ventral derinliği -1,2 mm'ye ayarlayarak darbe derinliğini ayarlayın.
    NOT: Darbenin derinliği yaralanmanın şiddetini etkiler. Derinlik, farklı yaşlar, ağırlıklar ve fare suşları için istenen yaralanma ciddiyetine göre ayarlanmalıdır. Tutarlı bir yaralanma şiddetini korumak için derinliğin zaman içinde ayarlanması/yeniden titreştirilmesi gerekebilir. Şiddet nöropatolojik olarak değerlendirilebilir: mikroglia ve astrositler (İmmünohistokimya (IHC)) ve davranışsal olarak: radyal kol su labirenti ve aktif kaçınma testi.
18. Anestezi derinliğini sağlamak ve gaz seviyesini gerektiği gibi ayarlamak için farenin solunumunu dikkatlice izleyin.
    NOT: Genellikle, izofluran gazı yüzdesi çarpmadan önce 10-20 saniye süreyle düşürülmeli veya kapatılmalıdır. Solunumun biraz hızlanmasını yakından izleyin. Çarpma anında solunum çok yavaşsa, hayvan apneden çarpmadan sonraki ilk 60 saniye içinde ölebilir. Bu, anestezinin derinliğini darbeden saniyeler önce ayarlayarak önlenebilir.
19. Darbeye doğru sağ geçiş anahtarına basarak darbeyi indükleyin. Prob ucu görüntülenen hızda aşağı iner ve ardından ayarlanan bekleme süresi boyunca aşağıda kalır ve geri çekilir.
    NOT: Sahte fareler, CHI fareleriyle aynı şekilde işlem görür, ancak etki sağlanmaz.
20. Sağa dönme sürelerini (yan konumdan yüzüstü konuma dönme süresi) kaydetmek için CHI etkisi verildikten hemen sonra zamanlayıcıyı başlatın veya sahte fareler için fare stereotaksik çerçeveden çıkarıldığında zamanlayıcıyı başlatın. Ortalama doğrultma refleks süresi 5-15 dakikadır.
    NOT: Düzeltme refleksi süreleri, fare zorlanmasına ve yaşına bağlı olarak değişebilir.
21. Fareleri görünür kafatası kırıkları, kanamalar ve apne açısından değerlendirin. Depresif kafatası kırığı veya görünür kanaması olan fareleri çalışmadan çıkarın.
    NOT: Kafatası kırıklarının kademeli seviyeleri vardır. Kemiğin beyin dokusuna gözle görülür şekilde baskı yaptığı dekompresyonlu kafatası kırıkları olan hayvanlara ötenazi yapılır (önce CO₂ ve ikincil bir yöntem olarak dekapitasyon kullanılır). Çarpma tertibatı ucu doğru ayarlanırsa, bu tür kafatası kırıkları son derece nadirdir. Bir kafatası kırığı meydana gelirse, daha yaygın olanı, kafatası üzerinde küçük bir damla kan ve genellikle burun kemiğinin arka ucunu bağlayan sütür boyunca kafatasının hafif dokunsal bir pürüzlenmesidir. Bu fareler, kayıtlarda olası kafatası kırıkları olarak belirtilmiştir, ancak normalde çalışmadan çıkarılmazlar.
22. Hayvanı stereotaksik çerçeveden çıkarın.
23. Cildi birbirine zımbalayarak kafa derisini kapatın.
    NOT: Zımbalara alternatif olarak kafa derisini kapatmak için emilebilir veya emilmeyen dikişler kullanılabilir.
24. Kapalı insizyona steril pamuk uçlu aplikatör ile üçlü antibiyotik merhem uygulayın.
25. Kurtarma için fareyi temiz bir tutma kafesine geri koyun. Kurtarma kafesinin yarısı, uyanıkken ısıdan uzaklaşma ve bilinçsizken hayvanın sıcaklığını koruma yeteneği sağlayan bir ısıtma yastığı (düşük ayar) üzerindedir (bkz. Şekil 1L).
    NOT: Fare, kurtarma kafesinde yan yatırılmıştır. Boğulmayı önlemek için, hayvanı yataksız bir kurtarma kafesine veya kafeste yatak takımı varsa bir mendil üzerine yerleştirin.
26. Genişlet/Geri Çek geçiş anahtarını Orta/Kapalı konumuna getirin.
    NOT: Anahtar uzatma veya geri çekme konumunda bırakılırsa akım çalışmaya devam eder ve pistonun şişmesine neden olur. Çarpma tertibatı daha sonra piston soğuyana kadar çalışmayacaktır.
27. Çarpma tertibatını tutucusundan çıkarın ve yavaşça buz torbasının üzerine yerleştirin.
    NOT: Çarpma tertibatını bir buz torbası üzerinde tutmak, çarpma tertibatının olası şişmesini azaltmaya yardımcı olur.
28. Hayvanı doğrultma refleksi oluşana kadar izleyin ve sağa dönene kadar geçen süreyi belgeleyin (bkz. Şekil 1M).
    NOT: Doğrultma refleksi, farenin yüzüstü pozisyona döndüğü an olarak tanımlanır. Kafesin rahatsız edilmeden bırakılması gerekir; Kafese dokunulduğunda, hareket ettirildiğinde veya bazı seslere maruz kaldığında fare doğru olabilir.
29. Fareleri uyanık ve uyanık olduklarında ev kafeslerine geri koyun. Genellikle, yaralanmadan sonraki 1 saat içinde hayvanlar tamamen bilinçli ve yürüyor. Ayrıca, kafesin altına biraz nemli yiyecek ekleyin.

Sonuçlar

Şekil 1: Adım 1: Cerrahi alan kurulumu. (A) CHI ameliyatını gerçekleştirmek için gereken cerrahi alan ve aletlerin bir örneği (çarpma tertibatı için buz paketi, çarpma tertibatı ile donatılmış stereotaksik çerçeve, çarpma tertibatı kontrol kutusu ve cerrahi aletler) gösterilmiştir. (B) 5 mm'lik çelik prob ucunun, ısırma çubuğunun ve kafa de...

Malzemeler

Bu makalede kullanılan malzemelerin listesi

Ad	Şirket	Katalog numarası	Yorumlar
9 mm Autoclip Applier	Braintree scientific	ACS- APL	Surgery
9 mm Autoclip Remover	Braintree scientific	ACS- RMV	Surgery
9 mm Autoclip, Case of 1,000 clips	Braintree scientific	ACS- CS	Surgery (Staples)
Aperio ImageScope software	Leica BioSystems	NA	IHC
BladeFLASK Blade Remover	Fisher Scientific	22-444-275	Surgery
Cotton uç aplikatörü	VWR	89031-270	Surgery
Digitial mouse stereotaxic frame	Stoelting	51730D	Surgery
Dumont #7 Forceps	Roboz	RS-5047	Surgery
Kulak çubukları	Stoelting	51649	Surgery
EthoVision XT 11.0	Noldus Information Technology	NA	RAWM
Fiber-Lite	Dolan-Jeffer Industries	UN16103-DG	Surgery
Fisherbrand Bulb for Small Pipets	Fisher Scientific	03-448-21	Baş destek aparatı
İkizler Kaçınma Sistemi	San Diego Instruments	NA	Active avoidance
Heating Pad	Sunbeam	732500000U	Surgery prep
HRP konjuge keçi anti-tavşan IgG	Jackson Immuno Research laboratories	111-065-144	IHC
İndüksiyon odası	Kent Scientific	VetFlo-0530XS	Surgery prep
Isoflurane, USP	Covetrus	NDC: 11695-6777-2	Surgery
Mouse gaz anestezi başlığı holder	Stoelting	51609M	Surgery
Neuropactor Stereotaxic Impactor<	n/a<
NexGen Mouse 500	Allentown	n/a	Ameliyat sonrası, tutma kafesi
Parafilm	Bemis	PM992	Baş destek aparatı
Peanut - Professional Hair Clipper	Whal	8655-200	Surgery prep
Povidon-İyot Solüsyonu USP, %10 (a/h)%1 (a/h) mevcut İyot, laboratuvar için	Ricca	3955-16	Surgery
Puralube Vet Oinment,vazelin oftalmik merhem, Steril oküler kayganlaştırıcı	Dechra	17033-211-38	Surgery
Rabbit anti-GFAP	Dako	Z0334	IHC
Rabbit anti-IBA1	Wako	019-19741	IHC
8 kollu Radyal Kol Su Labirenti	MazeEngineers	n/a<
Scale	OHAUS CS series	BAL-101	Surgery prep
Neşter Sapı #7 Katı 6.25"	Roboz	RS-9847	Surgery
Steril Alkol Hazırlama Pedleri (izopropil alkol %70 v/v)	Fisher Brand	22-363-750	Surgery prep
SumnoSuite düşük akışlı anestezi sistemi	Kent Scientific	SS-01	Surgery
10 mL şırınga Luer-Lok Tip	BD Bard-Parker	302995	Kafa destek aparatı
Timers	Fisher Scientific	6KED8	Cerrahi
Topikal anestezik krem	L.M.X 4	NDC 0496-0882-15	Cerrahi hazırlık
Üçlü antibiyotik merhem	Major	NDC 0904-0734-31	Post-opera
Tubing	MasterFlex	96410-16<
Vaporizan Tek Kanallı Anestezi Sistemi	Kent Scientific	VetFlo-1210S	Ameliyat hazırlığı

td style='width:149pt;'>Neuroscience Toolstd style='width:190pt;'>Cerrahi: Lecia tarafından resmi olarak darbe olarak dağıtılmıştırtd style='width:190pt;'>RAWMtd style='width:190pt;'>Baş destek aparatı