Bir fare arteriolar endotelinde kalsiyum dinamiği ve membran potansiyel değişikliklerinin analizi

Abstract

Kaynak: Hakim, M. A. et al., Fare Beyin Parankiminin Arteriolar Endotelinin İzolasyonu ve Fonksiyonel Analizi. J. Vis. Uzm. (2022).

Bu video, bir fare beyninden izole edilen bir arteriyolar endotel tüpünün fonksiyonel analizini göstermektedir. Hem başlangıçta hem de farmakolojik stimülasyona yanıt olarak hücre içi kalsiyum seviyelerini ve zar potansiyelini ölçmek için adımları ana hatlarıyla belirtir.

Protocol

Hayvan örneklerini içeren tüm prosedürler uygun hayvan etik tarafından gözden geçirilmiş ve onaylanmıştır. İnceleme Komitesi.

1. Malzemeler ve ekipman

NOT: See the Table of Materials bu protokol için gereken tüm reaktifler ve malzemeler için. Ek olarak, gerektiğinde ilgili satıcılarla ilişkili kılavuzlara ve web sitelerine de başvurulabilir.

1. Flow chamber
   1. Bir süperfüzyon odasını bir cam lamel ile anodize alüminyumdan oluşan bir platforma sabitleyin. Platformu hazne ile birlikte bir alüminyum mikroskop tablasına sabitleyin.
   2. Alüminyum mikroskop tablasında platformun her iki ucunda bir sabitleme pipeti tutan bir mikromanipülatör yerleştirin.
      NOTE: Gerekirse, deney için güvenli, izole edilmiş bir endotel tüpünü bir mikroskop cihazından diğerine taşımak için bir akış odası ünitesine sahip aktarılabilir bir aşama aparatı kullanın.
2. Mikroskoplar
   1. Ters çevrilmiş bir mikroskop (objektifler: 4x, 10x, 20x, 40x ve 60x) ve bir titreşim izolasyon tablası üzerinde manuel bir alüminyum tabla düzenleyerek deney cihazını kurun.
3. Hücre içi V_m kayıt ekipmanı
   1. Elektrometreyi uyumlu bir headstage'e bağlayın. Akım enjeksiyonu gerektiren protokoller için fonksiyon üreteci ve stimülatör gibi aksesuarlar kullanın.
   2. Amplifikatör çıkışlarını bir veri sayısallaştırma sistemine, osiloskopa ve sesli temel monitörlere bağlayın. Referans banyo elektrodunu (Ag/AgCl peleti) akış odası çıkışının yakınına sabitleyin.
   3. Floresan sistem arayüzü, yüksek yoğunluklu ark lambası ve güç kaynağı, hiper anahtar, fotoçoğaltıcı tüp (veya PMT) ve kameranın entegre bileşenleriyle bir fotometrik sistem oluşturun [Ca²⁺]_i.
   4. Deney boyunca fizyolojik bir sıcaklığı (37 °C) yükseltmek ve korumak için hat içi ısıtıcı ile donatılmış bir sıcaklık kontrol cihazı monte edin.
   5. Çözeltilerin hazneye sabitlenmiş endotel tüplerine iletilmesini kontrol etmek için bir hat içi akış kontrol vanası ile bir valf kontrolörüne bağlı çok kanallı bir platform monte edin.
4. Mikropipetler ve keskin elektrotlar
   NOT:<span style='font-family:Arial,sans-serif;font-size:12pt;font-style:normal;font-variant:normal;font-weight:400;text-decoration:none;vertical-align:baseline;white-space:pre-wrap;'> Deneyci, iğnelemeyi hazırlamak için elektronik bir cam çektirmeye ve bir mikro dövmeye ihtiyaç duyacaktır pipetler.
   1. Endotel tüpünü süperfüzyon odasına sabitlemek için, ince duvarlı borosilikat cam kılcal damarlardan hazırlanmış, körelmiş, küresel uçlu (dış çap: 50-70 μm) ısıyla parlatılmış iğneleme pipetleri hazırlayın.
   2. V_m, sadece cam çektirmeyi kullanarak cam kılcal damarlardan ~ 150 ± 30 MΩ uç direncine sahip keskin elektrotlar hazırlayın.

2. Solüsyonlar ve ilaçlar

1. Fizyolojik tuz çözeltisi (PSS)<ol style='margin-bottom:0;margin-top:0;padding-inline-start:48px;'>
2. 140 mM NaCl, 5 mM KCl, 2 mM CaCl='font-family:Arial,sans-serif;font-size:0.6em;font-style:normal;font-variant:normal;font-weight:400;text-decoration:none;vertical-align:baseline;white-space:pre-wrap;'>₂, 1 mM MgCl₂, 10mM N-2-hydroxyethylpiperazine-N'-2-etansülfonik asit (HEPES) ve 10 mM glikoz.
3. CaCl₂ (zero Ca²⁺ PSS) serebral arteriyollerin diseksiyonu ve endotel izolasyonu için Tüp.
   NOTE: Tümünü hazırla ultra saf deiyonize H₂O, ardından filtrasyon (0.22 μm). Nihai ürünün 290 ila 300 mOsm arasında ozmolaliteye sahip bir pH 7.4 içerdiğinden emin olun.

Fura-2 ve farmakolojik ajanlar

1. Fura-2 AM stoğunu dimetil sülfoksitte (DMSO; 1 mM) hazırlayın. Yükleme için 495 μL PSS'ye 5 μL stok ekleyerek 500 μL çalışma konsantrasyonu (10 μM) hazırlayın.
2. Uygun şekilde PSS veya DMSO'da en az 50 mL farmakolojik ajan çalışma konsantrasyonu hazırlayın.

Conductinging

1. Prepare 2 M KCl in deiyonize H'de çözerek ₂O (50 mL H='font-family:Arial,sans-serif;font-size:0.6em;font-style:normal;font-variant:normal;font-weight:400;text-decoration:none;vertical-align:baseline;white-space:pre-wrap;'>₂O). Keskin elektrotları geri doldurmadan önce çözeltiyi 0.22 μm filtreli bir şırıngadan geçirin.

3. Hücresel fizyolojinin incelenmesi için arteriolar endotel tüplerinin kullanımı

NOTE:<span style='font-family:Arial,sans-serif; yazı tipi boyutu: 12pt; font-style:normal; font-variant:normal; yazı tipi ağırlığı: 400; metin-dekorasyon:yok; dikey hizalama: taban çizgisi; white-space:pre-wrap;' > İzole edilmiş ve güvenli arteriyolar endotel tüpleri, [Ca²⁺]_i dynamics and V_m daha önce gösterildiği gibi sırasıyla fotometri ve keskin elektrot elektrofizyolojisi kullanılarak (Şekil 1). [Ca²⁺]_i ve V_m ayrı veya birleşik deneysel değişkenler (Figure 1). Bununla birlikte, arterioler endotel tüpleri, arteriyel endotelyumdan daha hassastır ve deney süresi 1 saati geçmemelidir.

1. Measurement of [Ca²⁺]_i
   1. [Ca²⁺]_i/ min.
   2. Endotel tüpünü Ca²⁺ Fura-2 AM'yi oda sıcaklığında 30 dakika boyayın. Banyo sıcaklığını kademeli olarak 37 ° C'ye yükseltirken hücreleri 20-30 dakika daha süperfüzyon solüsyonu ile yıkayın. Deney boyunca sıcaklığı 37 ° C'de tutun.
   3. ~20 endotel hücresine odaklanmak için fotometri yazılımını kullanarak görüntüleme penceresini manuel olarak ayarlayın (Figure 1A). Işık olmadığında, floresan arayüzünde PMT'yi açın ve [Ca²⁺]_i Fura-2'yi dönüşümlü olarak (≥10 Hz) 340 nm ve 380 nm'de heyecanlandırırken 510 nm'de floresan emisyonu toplayarak. Bir kez [Ca²⁺]_i kurulursa, farmakolojik ajanlar uygulayın (örneğin, purinerjik reseptör agonistler) deneysel hedefe göre (Figure 1B).
2. V_m
   1. V_m kayıtları yapın ve sürekli süperfüzyonu 5-7 mL/dk akış hızında tutarken veri toplama hızını (≥10 Hz) ayarlayın. Banyo sıcaklığını kademeli olarak 37 °C'ye yükseltin ve deneyin sonuna kadar koruyun.
   2. Borosilikat cam kılcal bir tel kullanarak keskin bir elektrot çekin, 2 M KCl ile doldurun ve sırayla bir mikromanipülatör tarafından tutulan bir elektrometreye bağlı pipet tutucusunda klorür ile kaplanmış gümüş bir tel üzerine sabitleyin.
   3. 4x objektiften bakarken, keskin elektrot ucunu arteriolar endotel tüpünün bir hücresinin hemen üzerine odadaki akan PSS'ye dikkatlice yerleştirmek için bir mikromanipülatör kullanın.
   4. Büyütmeyi kademeli olarak 400x'e yükseltin ve elektrot ucunu gerektiği gibi yeniden konumlandırın.
   5. Mikromanipülatörü kullanarak, keskin bir elektrotun ucunu endotel tüpünün hücrelerinden birine nazikçe sokun ve kayda başlayın V_m bir elektrometre (Figure 1A).

Bir kez endotel dinlenme V_m stabil (−30 ila −40 mV), istenen farmakolojik deneysel hedef başına ajanlar (Figure 1C).

Results

Şekil 1: Kan akımının düzenlenmesi ile ilgili yolakların fizyolojik incelenmesi için endotel tüpünün uygulanması.(A) Keskin bir elektrot (mor ok), fotometri için veri toplama penceresine odaklanmış bir endotel tüpünün bir hücresine yerleştirilir. (B) MTA'ya (1 μM) yanıt olarak Fura-2 fotometrisi kullanılarak hücre içi Ca^{2 +} 'nın temsili kaydı. (C

Materials