Bir fare arteriolar endotelinde kalsiyum dinamiği ve membran potansiyel değişikliklerinin analizi

Özet

Kaynak: Hakim, M. A. et al., Fare Beyin Parankiminin Arteriolar Endotelinin İzolasyonu ve Fonksiyonel Analizi. J. Vis. Uzm. (2022).

Bu video, bir fare beyninden izole edilen bir arteriyolar endotel tüpünün fonksiyonel analizini göstermektedir. Hem başlangıçta hem de farmakolojik stimülasyona yanıt olarak hücre içi kalsiyum seviyelerini ve zar potansiyelini ölçmek için adımları ana hatlarıyla belirtir.

Protokol

Hayvan örneklerini içeren tüm prosedürler uygun hayvan etik tarafından gözden geçirilmiş ve onaylanmıştır. İnceleme Komitesi.

1. Malzemeler ve ekipman

NOT: See the Table of Materials bu protokol için gereken tüm reaktifler ve malzemeler için. Ek olarak, gerektiğinde ilgili satıcılarla ilişkili kılavuzlara ve web sitelerine de başvurulabilir.

1. Flow chamber
   1. Bir süperfüzyon odasını bir cam lamel ile anodize alüminyumdan oluşan bir platforma sabitleyin. Platformu hazne ile birlikte bir alüminyum mikroskop tablasına sabitleyin.
   2. Alüminyum mikroskop tablasında platformun her iki ucunda bir sabitleme pipeti tutan bir mikromanipülatör yerleştirin.
      NOTE: Gerekirse, deney için güvenli, izole edilmiş bir endotel tüpünü bir mikroskop cihazından diğerine taşımak için bir akış odası ünitesine sahip aktarılabilir bir aşama aparatı kullanın.
2. Mikroskoplar
   1. Ters çevrilmiş bir mikroskop (objektifler: 4x, 10x, 20x, 40x ve 60x) ve bir titreşim izolasyon tablası üzerinde manuel bir alüminyum tabla düzenleyerek deney cihazını kurun.
3. Hücre içi V_m kayıt ekipmanı
   1. Elektrometreyi uyumlu bir headstage'e bağlayın. Akım enjeksiyonu gerektiren protokoller için fonksiyon üreteci ve stimülatör gibi aksesuarlar kullanın.
   2. Amplifikatör çıkışlarını bir veri sayısallaştırma sistemine, osiloskopa ve sesli temel monitörlere bağlayın. Referans banyo elektrodunu (Ag/AgCl peleti) akış odası çıkışının yakınına sabitleyin.
   3. Floresan sistem arayüzü, yüksek yoğunluklu ark lambası ve güç kaynağı, hiper anahtar, fotoçoğaltıcı tüp (veya PMT) ve kameranın entegre bileşenleriyle bir fotometrik sistem oluşturun [Ca²⁺]_i.
   4. Deney boyunca fizyolojik bir sıcaklığı (37 °C) yükseltmek ve korumak için hat içi ısıtıcı ile donatılmış bir sıcaklık kontrol cihazı monte edin.
   5. Çözeltilerin hazneye sabitlenmiş endotel tüplerine iletilmesini kontrol etmek için bir hat içi akış kontrol vanası ile bir valf kontrolörüne bağlı çok kanallı bir platform monte edin.
4. Mikropipetler ve keskin elektrotlar
   NOT:<span style='font-family:Arial,sans-serif;font-size:12pt;font-style:normal;font-variant:normal;font-weight:400;text-decoration:none;vertical-align:baseline;white-space:pre-wrap;'> Deneyci, iğnelemeyi hazırlamak için elektronik bir cam çektirmeye ve bir mikro dövmeye ihtiyaç duyacaktır pipetler.
   1. Endotel tüpünü süperfüzyon odasına sabitlemek için, ince duvarlı borosilikat cam kılcal damarlardan hazırlanmış, körelmiş, küresel uçlu (dış çap: 50-70 μm) ısıyla parlatılmış iğneleme pipetleri hazırlayın.
   2. V_m, sadece cam çektirmeyi kullanarak cam kılcal damarlardan ~ 150 ± 30 MΩ uç direncine sahip keskin elektrotlar hazırlayın.

2. Solüsyonlar ve ilaçlar

1. Fizyolojik tuz çözeltisi (PSS)<ol style='margin-bottom:0;margin-top:0;padding-inline-start:48px;'>
2. 140 mM NaCl, 5 mM KCl, 2 mM CaCl='font-family:Arial,sans-serif;font-size:0.6em;font-style:normal;font-variant:normal;font-weight:400;text-decoration:none;vertical-align:baseline;white-space:pre-wrap;'>₂, 1 mM MgCl₂, 10mM N-2-hydroxyethylpiperazine-N'-2-etansülfonik asit (HEPES) ve 10 mM glikoz.
3. CaCl₂ (zero Ca²⁺ PSS) serebral arteriyollerin diseksiyonu ve endotel izolasyonu için Tüp.
   NOTE: Tümünü hazırla ultra saf deiyonize H₂O, ardından filtrasyon (0.22 μm). Nihai ürünün 290 ila 300 mOsm arasında ozmolaliteye sahip bir pH 7.4 içerdiğinden emin olun.

Fura-2 ve farmakolojik ajanlar

1. Fura-2 AM stoğunu dimetil sülfoksitte (DMSO; 1 mM) hazırlayın. Yükleme için 495 μL PSS'ye 5 μL stok ekleyerek 500 μL çalışma konsantrasyonu (10 μM) hazırlayın.
2. Uygun şekilde PSS veya DMSO'da en az 50 mL farmakolojik ajan çalışma konsantrasyonu hazırlayın.

Conductinging

1. Prepare 2 M KCl in deiyonize H'de çözerek ₂O (50 mL H='font-family:Arial,sans-serif;font-size:0.6em;font-style:normal;font-variant:normal;font-weight:400;text-decoration:none;vertical-align:baseline;white-space:pre-wrap;'>₂O). Keskin elektrotları geri doldurmadan önce çözeltiyi 0.22 μm filtreli bir şırıngadan geçirin.

3. Hücresel fizyolojinin incelenmesi için arteriolar endotel tüplerinin kullanımı

NOTE:<span style='font-family:Arial,sans-serif; yazı tipi boyutu: 12pt; font-style:normal; font-variant:normal; yazı tipi ağırlığı: 400; metin-dekorasyon:yok; dikey hizalama: taban çizgisi; white-space:pre-wrap;' > İzole edilmiş ve güvenli arteriyolar endotel tüpleri, [Ca²⁺]_i dynamics and V_m daha önce gösterildiği gibi sırasıyla fotometri ve keskin elektrot elektrofizyolojisi kullanılarak (Şekil 1). [Ca²⁺]_i ve V_m ayrı veya birleşik deneysel değişkenler (Figure 1). Bununla birlikte, arterioler endotel tüpleri, arteriyel endotelyumdan daha hassastır ve deney süresi 1 saati geçmemelidir.

1. Measurement of [Ca²⁺]_i
   1. [Ca²⁺]_i/ min.
   2. Endotel tüpünü Ca²⁺ Fura-2 AM'yi oda sıcaklığında 30 dakika boyayın. Banyo sıcaklığını kademeli olarak 37 ° C'ye yükseltirken hücreleri 20-30 dakika daha süperfüzyon solüsyonu ile yıkayın. Deney boyunca sıcaklığı 37 ° C'de tutun.
   3. ~20 endotel hücresine odaklanmak için fotometri yazılımını kullanarak görüntüleme penceresini manuel olarak ayarlayın (Figure 1A). Işık olmadığında, floresan arayüzünde PMT'yi açın ve [Ca²⁺]_i Fura-2'yi dönüşümlü olarak (≥10 Hz) 340 nm ve 380 nm'de heyecanlandırırken 510 nm'de floresan emisyonu toplayarak. Bir kez [Ca²⁺]_i kurulursa, farmakolojik ajanlar uygulayın (örneğin, purinerjik reseptör agonistler) deneysel hedefe göre (Figure 1B).
2. V_m
   1. V_m kayıtları yapın ve sürekli süperfüzyonu 5-7 mL/dk akış hızında tutarken veri toplama hızını (≥10 Hz) ayarlayın. Banyo sıcaklığını kademeli olarak 37 °C'ye yükseltin ve deneyin sonuna kadar koruyun.
   2. Borosilikat cam kılcal bir tel kullanarak keskin bir elektrot çekin, 2 M KCl ile doldurun ve sırayla bir mikromanipülatör tarafından tutulan bir elektrometreye bağlı pipet tutucusunda klorür ile kaplanmış gümüş bir tel üzerine sabitleyin.
   3. 4x objektiften bakarken, keskin elektrot ucunu arteriolar endotel tüpünün bir hücresinin hemen üzerine odadaki akan PSS'ye dikkatlice yerleştirmek için bir mikromanipülatör kullanın.
   4. Büyütmeyi kademeli olarak 400x'e yükseltin ve elektrot ucunu gerektiği gibi yeniden konumlandırın.
   5. Mikromanipülatörü kullanarak, keskin bir elektrotun ucunu endotel tüpünün hücrelerinden birine nazikçe sokun ve kayda başlayın V_m bir elektrometre (Figure 1A).

Bir kez endotel dinlenme V_m stabil (−30 ila −40 mV), istenen farmakolojik deneysel hedef başına ajanlar (Figure 1C).

Sonuçlar

Şekil 1: Kan akımının düzenlenmesi ile ilgili yolakların fizyolojik incelenmesi için endotel tüpünün uygulanması.(A) Keskin bir elektrot (mor ok), fotometri için veri toplama penceresine odaklanmış bir endotel tüpünün bir hücresine yerleştirilir. (B) MTA'ya (1 μM) yanıt olarak Fura-2 fotometrisi kullanılarak hücre içi Ca^{2 +} 'nın temsili kaydı. (C

Malzemeler

Bu makalede kullanılan malzemelerin listesi

Ad	Şirket	Katalog numarası	Yorumlar
Amplifiers	Molecular Devices, Sunnyvale, CA, ABD	Axoclamp 2B ve Axoclamp 900A
Sesli temel monitörler	Ampol US LLC, Sarasota, FL, ABD	BM-A-TM
Banyo Soğutucu (Isotemp 500LCU)	ThermoFisher Scientific	13874647
Borosilikat cam kılcal damarlar (Sabitleme)	Warner Instruments	G150T-6
Borosilikat cam kılcal damarlar (Keskin Elektrotlar)	Warner Instruments	GC100F-10
BSA: Bovine Serum Albumin	Sigma	A7906
CaCl2: Calcium Chloride	Sigma	223506
DMSO: Dimethyl Sulfoxide	Sigma	D8418
Flow Control Valve	Warner Instruments	FR-50
Floresan sistem arayüzü, ARC lambası ve güç kaynağı, hiperswitch ve PMT	Moleküler Cihazlar, Sunnyvale, CA, ABD	IonOptix Systems
Function Generator	EZ Digital, Seul, Güney Kore	FG-8002
Fura-2 AM boya	Invitrogen, Carlsbad, CA, ABD	F14185
Glucose	Sigma-Aldrich (St. Louis, MO, ABD)	G7021
HCl: Hidroklorik Asit	ThermoFisher Scientific (Pittsburgh, PA, ABD)	A466250
Headstages	Moleküler Cihazlar	HS-2A ve HS-9A
HEPES: (4- (2-hidroksietil)-1-piperazineetansülfonik asit)	Sigma	H4034
Inline Solution Isıtıcı	Warner Instruments	SH-27B
KCl: Potasyum Klorür	Sigma	P9541
MgCl2: Magnezyum Klorür	Sigma	M2670
Microforge	Narishige, East Meadow, NY, ABD	MF-900
Micromanipülator	Siskiyou	MX10
Micropipette çektirme (dijital)	Sutter Instruments, Novato, CA, ABD	P-97 veya P-1000
Mikroskop (Nikon-ters çevrilmiş)	Nikon Instruments Inc, Melville, NY, ABD	Ts2
Mikroskop ( Nikon Instruments	Inc	Eclipse TS100
Mikroskop objektifleri	Nikon Instruments Inc	20X (S-Fluor) and 40X (Plan Fluor)
Mikroskop platformu (anodize alüminyum; çap, 7,8 cm)	Warner Instruments	PM6 or PH6
Mikroskop Tablası (Alüminyum)	Siskiyou, Grants Pass, VEYA, ABD	8090P
MTA: 2-Metiltioadenosin difosfat trisodyum tuzu	Tocris	1624
NaCl: Sodyum Klorür	Sigma	S7653
NaOH: Sodyum Hidroksit	Sigma	S8045
Osiloskop	Tektronix, Beaverton, Oregon, ABD	TDS 2024B
Faz kontrast hedefleri	Nikon Instruments Inc	(Ph1 DL; 10X & 20X)
Pleksiglas süperfüzyon odası	Warner Instruments, Camden, CT, ABD	RC-27
Stereomikroskoplar	Zeiss, NY, ABD	Stemi 2000 & 2000-C
Şırınga filtresi (0,22 μm)	ThermoFisher Scientific	722-2520
Sıcaklık Kontrol Cihazı (Çift Kanallı)	Warner Instruments	TC-344B or C
Valve Control System	Warner Instruments	VC-6
Titreşim İzolasyon Tablası	Teknik İmalatı, Peabody, MA, ABD	Micro-g