Kronik Epilepsi ile İndüklenen Sıçanlarda Uyarıcı Nörotransmitter Düzeylerinin Değerlendirilmesi

Özet

Kaynak: Soukupová, M., et al. Serbest hareket eden sıçanlarda EEG kayıtları sırasında uyarıcı amino asitlerin mikrodiyalizi. J. Vis. Uzm. (2018)

Bu video, kronik epilepsi indüksiyonu olan sıçanlarda hücre dışı uyarıcı nörotransmitter seviyelerinin değerlendirmesini göstermektedir. Beyne bir mikrodiyaliz probu implante ettikten ve elektroensefalografi (EEG) kullanılarak nöbet olmadığını doğruladıktan sonra, epileptik sıçanlarda yüksek nörotransmitter seviyelerini değerlendirmek için hücre dışı sıvı toplanır. Daha sonra, nöronal uyarılabilirliği sürdürmek ve nörotransmiterlerin artan salınımını tetiklemek için yüksek potasyumlu bir çözelti infüze edilir ve uyarıcı nörotransmiterlerde potasyumun neden olduğu zirveyi değerlendirmek için örnekler toplanır.

Protokol

Hayvan modellerini içeren tüm prosedürler, yerel kurumsal hayvan bakım komitesi ve JoVE veteriner inceleme kurulu tarafından gözden geçirilmiştir.

Bu protokol, epileptik ve epileptik olmayan sıçanlarda mikrodiyaliz seanslarının EEG kontrolü altında elde edilen sıçan beyin diyalizatlarında glutamat ve aspartat tayini için özel olarak ayarlanmıştır. Burada tarif edilen materyallerin çoğu, EEG kayıtları veya mikrodiyaliz için laboratuvarında kullanılanlarla kolayca değiştirilebilir.

1. Mikrodiyaliz Prob elektrot Cihazının Montajı

1. 3 kanallı iki bükümlü bir elektrot kullanın (kayıt elektrodunun en az 20 mm kesme uzunluğu ve 10 cm uzunluğunda bir topraklama elektrodu ile) ve cihazı hazırlamak için bir kılavuz kanül ile birleştirin. Şekil 1A-1B'deki diyaliz için 3 kanallı elektrot ve kılavuz kanül örneklerine bakınız.
2. Hayvanda mikrodiyaliz probu için geçiş yaptığı anda çıkarılmasını kolaylaştırmak için metal kılavuz kanülü kullanımdan önce birkaç kez kukla plastik kanülün içine çıkarın (Şekil 1C) ve yerleştirin (Şekil 1D).
3. Telleri kılavuzun kukla kanülü ile hizalamak için kayıt elektrodunun bükülmüş tellerini iki kez bükün (Şekil 1E-1F) ve elektrot ucunu (Şekil 1G) kılavuz kanülün ucundan 0.5 mm daha uzun olacak şekilde kesin (Şekil 1H) dijital kumpas kullanarak.
4. 1 mm uzunluğundaki silikon çemberi (OD 2 mm, kalınlık 0,3 mm; Şekil 1I) hazırlayın ve kılavuz kanülün ucunu ve bükülmüş elektrotların ucunu cımbız kullanarak silikon çembere yerleştirin (Şekil 1J). Hızlı etkili polimer yapıştırıcı veya reçine ile kılavuz kanül kaidesinin ayağına sabitleyin (Şekil 1K). Şekil 1L ve Şekil 2A'daki tamamlanmış cihazların örneğine bakın.
5. Cihazı antiseptik UV ışığı altında 4 saat sterilize edin. Cihazı, her bir tarafı 1 saat boyunca ışığa maruz kalacak şekilde dört kez ters çevirin.
   Not: Birçok ev yapımı elektrot ve mikrodiyaliz probu benzer şekilde monte edilebilir. Sıçanlar için yukarıda tarif edilen implantın başı aşağıdaki boyutlara sahiptir: 7 mm genişlik x 5 mm derinlik x üstten kaide parmağına kadar 10 mm uzunluk; İmplant ucu yaklaşık 11 mm uzunluğunda, 600 μm çapındadır ve tüm cihaz yaklaşık 330-360 mg ağırlığındadır. (i) Ameliyat sırasında bir sonraki kullanım için kafatası üzerinde yeterli uzunlukta toprak elektrodu bırakılırsa ve (ii) hayvan öldürülürse ve cihaz diş çimentosu ile birlikte geri kazanıldığında, çimentonun mekanik olarak ayrılabilmesi için gece boyunca aseton içinde bırakılırsa, cihaz iki veya üç kez tekrar kullanılabilir, Ve cihaz tekrar yıkandı ve sterilize edildi.

2. Stereotaksik Cerrahi

:

1. Aseptik ve ağrısız ameliyatlar için çağdaş standartları takip eden cihaz implantasyonu için stereotaksik bir cihaz ve prob klipsi tutucusu (Şekil 2B) kullanın.
   1. Erişkin Sprague-Dawley sıçanlarını ketamin / ksilazin karışımı (43 mg / kg ve 7 mg / kg, ip) ile uyuşturun ve stereotaksik çerçeveye sabitleyin. Anestezi derinliğini zaman içinde kontrol etmeye izin verdiği için ilk ketamin / ksilazin enjeksiyonuna izofluran anestezisi (havada% 1.4; 1.2 mL / dak) ekleyin. Hayvanın kafasındaki kürkü tıraş edin.
2. Kafa derisi yüzeyini iyot bazlı solüsyon ve ardından aseptik cerrahiye hazırlamak için% 70 etanol ile temizleyin.
   1. Öncelikli olarak (1.1 – 1.5) hazırlanan kılavuz kanül-elektrot cihazını aşağıdaki koordinatları kullanarak sağ ventral hipokampusa implante edin: burun çubuğu + 5.0 mm, A – 3.4 mm, L + 4.5 mm, P + 6.5 mm bregmaya. Stereotaksik ameliyatlar için standart teknikleri izleyin.
   2. Ankraj vidalarını kapatmadığından emin olun. Stereotaksik cihaza monte ederken, cihazı kılavuz kanül kafası için kavrayın, çünkü bu, prob tutucuya kolayca hizalanabilir.
3. Cihazı kafatası kemiğine vidalayarak en az dört paslanmaz vidayla kafatasına sabitleyin (sola 1 vida ve sağ ön kemik plakalarına 1 vida, sol parietale 1 vida ve interparietal kemik plakalarına 1 vida). Her vidayı kafatası kemiğine daha fazla sabitlemek için bir damla doku yapıştırıcısı ekleyin.
   1. Vida dişlerinin yarısını metakrilik çimento ile kaplayın. Yapışmayı artırmak için kemikte sığ oluklar açarak çimentonun bağlanmasını teşvik edin.
4. Cihazın ucu beyin dokusuna yerleştirildikten sonra, toprak elektrodunun telini 3 sabitleme vidasının etrafında bükün. Monte edilmiş tüm vidaları ve cihazı diş çimentosu ile kapatın.
5. Ameliyat sırasında ve daha sonra yaklaşık 1 saat boyunca kafesin etrafında dik durana ve hareket edene kadar hayvanları izleyin. Hipotermiyi önlemek için onları bir ısıtma pedi üzerinde tutun. Cihaz implantasyonundan sonra farelerin en az 7 gün iyileşmesine izin verin.
6. Ameliyattan sonraki 3 gün boyunca hayvanları günde en az bir kez ağrı veya sıkıntı belirtileri açısından izleyin. Enfeksiyonu önlemek için hayvanlara antibiyotikli krem (gentamisin% 0.1) ve ameliyat sonrası ağrıyı önlemek için 3 gün boyunca analjezik (tramadol 5 mg / kg, intraperitoneal [i.p.]) verin.

3. Pilokarpin ile Temporal Lob Epilepsi İndüksiyonu ve Hayvanların Deney Gruplarına Atanması Cerrahi

sonrası

1. iyileşmeden bir hafta sonra, hayvanları rastgele gruplara ayırın: (i) araç alan kontrol hayvanları ve (ii) pilokarpin alacak epileptik hayvanlar. Epileptik grup için orantılı olarak daha fazla sayıda hayvan kullanın, çünkü pilokarpin uygulanan tüm sıçanlar hastalığı geliştirmeyecektir.
2. Bir doz metilskopolamin (1 mg / kg, deri altı [sc]) enjekte edin ve 30 dakika sonra, status epileptikusu (SE) indüklemek için tek bir pilokarpin enjeksiyonu (350 mg / kg, ip) enjekte edin. Metilskopolamin ve aracı (salin) kontrol farelerine enjekte edin. Tüm i.p. uygulamaları için 25G iğneli 1 mL şırınga kullanın.
   1. Davranışsal nöbetler geçirmeye başlamak için hayvanları görsel olarak kontrol edin (vibrissa'yı 5 dakika içinde hareket ettirmek, başını sallamak, uzuvları klonlamak) ve 25 dakika içinde tüm vücudu sürekli klonlamak (SE).
3. Başlangıçtan 2 saat sonra SE'yi durdurun, yaklaşık% 25'lik bir mortaliteye ve diazepam (20 mg / kg, ip) uygulamasıyla yaklaşık 10 günlük bir ortalama latent döneme sahip olun. Pilokarpin enjeksiyonundan hemen sonra başlayan herhangi bir nöbet davranışını gözlemleyin ve kaydedin ve bundan sonra en az 6 saat devam edin.
4. Hayvanlara salin (1 mL, i.p.) 25G iğneli 1 mL şırınga ve 1 mL şırınga kullanarak sükroz çözeltisi (1 mL, os başına [p.o.]) ve SE'den sonra 2-3 gün boyunca esnek besleme 17G iğne kullanarak verin vücut ağırlığı kaybının geri kazanılmasını teşvik etmek için.
   1. Pilokarpin SE'den sonraki ilk hafta içinde ilk vücut ağırlığına ulaşamayan hayvanları çalışmadan hariç tutun (vücut ağırlığı takibinin mümkün olmadığı SE'den 24 saat sonra öldürülen akut grup hariç).
5. SE sonrası hayvanları rastgele farklı deney gruplarına atayın (Şekil 3): akut faz (mikrodiyalizin SE'den 24 saat sonra gerçekleştiği), latans (SE'den 7-9 gün sonra), ilk spontan nöbet (SE'den yaklaşık 11 gün sonra) ve kronik dönem (SE'den yaklaşık 22-24 gün sonra başlar, yani ilk nöbetten yaklaşık 10 gün sonra). Hayvanları spontan nöbetlerin oluşumu açısından izleyin.
   NOT: Epileptik sıçanlarda daha ileri deneyler için aşağıdaki dahil etme / hariç tutma kriterlerini kullanın: pilokarpin uygulamasından sonraki 1 saat içinde konvülsif SE gelişimi; SE'den sonraki ilk hafta kilo alımı ve mikrodiyaliz probu ile elektrotun doğru konumlandırılması.

4. Epileptik Davranış İzleme ve Analiz

1. Epileptik davranışın uzun süreli izlenmesi
   1. Pilokarpin uygulamasından yaklaşık 6 saat sonra (yani, araştırmacılar tarafından doğrudan gözlem sonunda), hayvanları temiz ev kafeslerine yerleştirin ve 24 saatlik video izlemeye başlayın.
   2. Dijital video gözetim sistemi kullanarak 5. güne kadar 24 saat video izlemeye devam edin.
   3. 5. günden itibaren, fareleri evlerindeki dikdörtgen kafeslerde bağlı EEG kayıt sistemine bağlayın ve 24 saat video izlemeye devam edin.
   4. Faraday kafesinin dışına yerleştirilmiş amplifikatördeki parametreleri ayarlayın (her bir hayvanın EEG sinyalinin özgüllüğüne göre her kanalda amplifikasyon faktörünü ayarlayın) ve bağlı olmayan kablolar tarafından üretilen EEG sinyalini gözlemleyerek EEG alımını başlatın. Örnekleme hızı 200 Hz ve düşük geçiren filtreyi 0,5 Hz olarak ayarlayın.
   5. Hayvanı kablolara bağlayın, bir elinizin iki gerilmiş parmağı arasında bir hayvanın kafasını tutun ve diğer serbest elinizi kullanarak konektörleri elektrot kaidesine vidalayın. Alımı başlatın.
      DİKKAT: Sinyalde yapaylık olmadığından emin olun. Yaygın eserler, ölçeği büyük ölçüde aşan sivri uçlardır.
   6. Mikrodiyaliz deneyinden bir gün önce, hayvanları mikrodiyaliz için pleksiglas silindirlerle donatılmış bağlı EEG sistemine aktarın. Hayvanları ev kafesindeki EEG bağlama sisteminden ayırın ve hayvanı dizginlemeden elektrottan konektörleri vidalayın. Hayvanı yüksek pleksiglas silindirlere yerleştirin.
2. Mikrodiyaliz seansından bir gün önce ve sırasında epileptik davranışın izlenmesi
   1. Faraday kafesinin dışına yerleştirilmiş amplifikatörü açın. EEG yazılımını açın. Bağlı olmayan kablolar tarafından üretilen EEG sinyalini gözlemleyerek EEG alımını başlatın.
   2. Hayvanı bağlı EEG kayıt sistemine bağlayın, bir elinizin kafasını iki gerilmiş parmağı arasında tutun ve diğer serbest elinizi kullanarak konektörleri elektrot kaidesine vidalayın. EEG sinyalinin ölçekli olması için tek bir hayvanın elektrot sinyaline göre amplifikatörün her kanalında bir amplifikasyon faktörü (kazanç) ayarlayın. Hayvanın, araştırmacının doğrudan gözlemi altında en az 1 saat boyunca yeni kafesi (silindir) keşfetmesine izin verin.
   3. NOT: Mikrodiyaliz deneyinden 24 saat önce, sıçanlar, kılavuz kanüllerin mikrodiyaliz probuna geçişi için kısa bir süre izofluran ile uyuşturulur. Onları EEG kayıt sistemine bağlamak için uyuşturuldukları andan yararlanın.
   4. Sarkık kabloyu hayvanın malına göre kısaltın veya uzatın. Kabloların hayvanın hareketlerine ve yatış duruşuna müdahale etmediğinden emin olun.
   5. Video kameraların doğru görüntü kadrajını kontrol edin. Video-EEG kaydını başlatın.
3. Nöbetlerin ve EEG aktivitesinin tanımlanması
   1. Videoları izlemek için bir yazılım oynatıcı kullanın. Filmi gerçek zamanlı oynatmadan 8 kat daha hızlı kaydırın ve genelleştirilmiş nöbetleri bireyselleştirin (bkz. ön ayak klonusu ile hayvandan arkaya veya ön ayak klonus ile hayvan yetiştirme ve düşme). Videoyu yavaşlatın ve davranışsal nöbetin başlangıcının ve bitişinin kesin zamanını not edin.
   2. Verileri, 24 saatlik video kayıtlarında gözlenen genelleştirilmiş nöbetlerin sayısını sayarak işleyin ve bunları, 24 saat içinde gözlemlenen tüm nöbetlerin ortalama değerleri olarak nöbet sıklığı ve süresi açısından ifade edin.
   3. EEG nöbetlerini, en az 3 saniye veya benzeri süren spike frekansının ilerlemesi ile taban çizgisine göre >3 kat genlik artışı ile karakterize edilen yüksek frekanslı (>5 Hz) paroksismal aktivite dönemleri olarak tanımlayın. Ham EEG kayıtlarını işlemek için EEG yazılımını kullanın. EEG izlerini 1 saatlik kesirlere bölün. EEG izleme fraksiyonlarını yazılım otomatik spike analizi için dosyaya kopyalayın.
   4. EEG yazılımını ve önceden tanımlanmış parametreleri (4.3.3.) kullanarak EEG aktivite verilerini analiz eder. Tüm video analizlerini, analiz edilen hayvan grubuna kör olan iki bağımsız araştırmacıda gerçekleştirin. Ayrışma durumunda, bir fikir birliğine varmak için verileri birlikte yeniden incelemelerini sağlayın.

5. Mikrodiyaliz

1. In vitro prob kurtarma
   1. Probu, üreticinin talimatlarına göre koruyucu kılıfında tutarak ilk kullanımı için hazırlayın.
   2. Deneyi üç nüsha halinde çalıştırın: üç adet 1,5 mL'lik test tüpü hazırlayın, bunları standartların karışımını (2,5 μM glutamat ve 2,5 μM aspartat) içeren 1 mL Ringer solüsyonu ile doldurun. Üç adet yüklü 1,5 mL test tüpünü 37 °C'ye ayarlanmış blok ısıtıcıya koyun ve karıştırıcının üzerine yerleştirin.
      NOT: Kromatografi kalibrasyonları için aynı standart çözeltileri kullanın.
   3. 1.5 mL'lik test tüplerini parafin film ile kapatın ve yaklaşık 1 mm çapında bir delik açmak için keskin cımbızla delin.
   4. Probu alın ve parafin filmden yapılan deliğe yerleştirin. Membranı çözelti seviyesinin en az 2 mm altına daldırın. Probu parafin filmi ile 1,5 mL test tüpüne sabitleyin.
      DİKKAT: Ucun 1,5 mL test tüpünün duvarlarına temas etmediğinden emin olun.
   5. Prob girişini, florlu etilen propilen (FEP) - boru ve boru adaptörleri kullanarak infüzyon pompasına monte edilen şırıngaya bağlayın. İsteğe bağlı olarak, bağlantılar için 0,28 mm iç çap (ID) ve 0,61 mm dış çap (OD) olan ince delikli polietilen boru ve renkli boru adaptörleri (kırmızı ve mavi boru adaptörleri) kullanın.
   6. Pompayı 2 μL/dk'da başlatın ve sıvının çıkış ucunda görünmesine izin verin. FEP boru ve boru adaptörlerini kullanarak prob çıkışını 0.2 mL toplama test tüpüne bağlayın.
      NOT: Tüm bağlantılar için FEP boru kullanın. Bir tıraş bıçağı kullanarak istediğiniz uzunlukta boruyu kesin. Probun girişi ve çıkışı için farklı renkte boru adaptörleri kullanın. Pompayı 60 dakika çalıştırın. Sızıntı ve hava kabarcıkları olup olmadığını kontrol edin. Bunların bulunmaması gerekir.
   7. Pompayı 2 μL/dk akış hızına ayarlayın ve numuneleri borunun çıkış tarafında toplamaya başlayın.
   8. 1.5 mL test tüpünde üç adet 30 dakikalık perfüzat numunesi ve çözeltinin üç eşit hacimli numunesini toplayın. 1.5 mL test tüpündeki standart çözeltiye daldırılmış mikroşırıngayı kullanarak her 30 dakikada bir 1.5 mL test tüpünden eşit hacimli numuneleri alın.
   9. İki farklı perfüzyon akış hızı kullanırken bir prob geri kazanım karşılaştırması yapmak için pompayı 3 μL/dak (5.1.7) akış hızına ayarlayarak deneyi (5.1.1-5.1.8) tekrarlayın.
   10. Bittiğinde, pompayı durdurun ve boruyu damıtılmış su,% 70 etanol ile durulayın ve havayı içine itin. Probu temiz damıtılmış su ile doldurulmuş bir şişede saklayın. Depolamadan önce probu damıtılmış su ile 2 μL/dk'da perfüze ederek iyice durulayın.
   11. Numunelerdeki glutamat ve aspartat konsantrasyonunu kromatografi ile analiz edin.
   12. Aşağıdaki denklemi kullanarak geri kazanımı hesaplayın:
       Kurtarma (%) = (C_perfüze /C_{diyaliz çözeltisi}) x 100.
Serbest
2. hareket eden sıçanlarda mikrodiyaliz seansları
   1. Hazırlık prosedürleri: prob yerleştirme ve testi, infüzyon pompası ayarı ve başlatma
      1. Mikrodiyaliz problarını üreticinin kullanım kılavuzuna göre ilk kullanım için hazırlayın ve bunları Ringer solüsyonu ile doldurun. Yaklaşık 10 cm uzunluğunda FEP boru parçaları kesin ve bunları farklı renkteki boru adaptörlerini kullanarak probun giriş ve çıkış kanüllerine bağlayın.
      2. Borunun tüm bağlantılarda ölü boşluk kalmayacak şekilde adaptörlere temas ettiğinden emin olun.
      3. Mikrodiyaliz deneyinden 24 saat önce, hayvanı bir indüksiyon odasında yaslanana kadar izofluran (havada% 5) ile kısa bir süre uyuşturun. Cımbızı kullanarak ve hayvanın kafasını sıkıca tutarak sahte kanülü kılavuzundan çıkarın. Diyaliz membranı ile donatılmış mikrodiyaliz probunu kılavuz kanüle yerleştirin ve kili modelleyerek kılavuzlarına yerleştirilen mikrodiyaliz kanüllerini daha da sıkılaştırın.
         DİKKAT: Çıkarırken probun koruyucu prob manşonunun duvarlarına temas etmesine izin vermeyin.
      4. Hayvanı pleksiglas silindirin içine koyun ve yeni ambiyansı keşfetmesine izin verin. Hayvanı yukarıda açıklandığı gibi bağlı EEG kayıt sistemine bağlayın (4.2.2 ve 4.2.3 maddelerini izleyin).
      5. Uyanık ve serbestçe hareket eden sıçan hareketlerini takip edin ve probun girişini, boru adaptörlerini kullanarak Ringer solüsyonu içeren körelmiş 2.5G iğne ile 22 mL şırıngaya bağlayın. Ringer solüsyonunu probun içine itin, 1 mL Ringer solüsyonunu 10 saniye içinde püskürtün ve 2,5 mL şırınganın pistonunu sürekli olarak itin. Çıkışta görünen sıvının damlasını kontrol edin. Prob artık kullanıma hazırdır.
      6. FEP tüpüne bağlı 2.5 mL şırıngaları Ringer solüsyonu ile boru adaptörleri ile doldurun ve infüzyon pompasına monte edin. Pompayı 2 μL/dk'da başlatın. Gece boyunca çalışmasına izin verin.
         NOT: Tüm FEP tüplerinin istenen uzunluğunu kullanın, ancak yüksek K ⁺ stimülasyonunun ne zaman başlatılması gerektiğini bilmek ve niceleme verilerini hayvan beynindeki nörokimyasal değişikliklerle ilişkilendirmek için boru ölü hacmini hesaplayın. Bu süreyi hesaplamak için çalışma akışının altındaki boruda oluşan hava kabarcığını kullanın.
   2. EEG kaydı ve potasyum stimülasyonu sırasında örneklerin toplanması
      1. Örnek toplamanın başlamasından önceki 3 saat içinde nöbet olmadığını doğrulayın (video-EEG kayıtları) ve mikrodiyaliz sırasında nöbet aktivitesini izlemeye devam edin.
      2. Ringer solüsyonu ile doldurulmuş FEP tüp kanüllü şırıngaları taşıyan pompayı durdurun. Pompanın üzerine, 2.5 mM K ⁺ çözeltisi içeren modifiye edilmiş bir Ringer çözeltisi ile doldurulmuş boru adaptörleri ile FEP tüpüne bağlı başka bir 100 mL şırınga seti monte edin.
      3. Pompayı 2 μL/dk'da başlatın ve çalışmasına izin verin. Borunun daha hızlı doldurulması için, pompayı doldurma süresi için 5 μL/dk'ya ayarlayın. Sistemde hava kabarcığı olup olmadığını kontrol edin. Borunun tüm bağlantılarda ölü boşluk kalmayacak şekilde adaptörlere temas ettiğinden emin olun.
      4. Probu yukarıda açıklandığı gibi hayvanda kullanıma hazır olup olmadığını test edin (5.2.1.5).
      5. NOT: Herhangi bir nedenle prob çalışmazsa, değiştirin. Bu durumlar için, mikrodiyaliz-EEG iş istasyonunun yakınında kullanıma hazır birkaç hazırlanmış mikrodiyaliz probunu bulundurun. Hayvanı EEG kablolarından ayırın ve değişikliği gerçekleştirmek için gerekirse izofluran ile kısa bir süre uyuşturun.
      6. Ringer solüsyonu ile doldurulmuş şırıngaların FEP tüpünü her hayvandaki probun giriş kanülüne bağlayın ve çıkışın ucundaki sıvı damlasının görünmesini bekleyin.
      7. Probun çıkışını FEP tüpüne bağlayın, bu da test tüpünde toplanmaya yol açar. FEP tüpünü delikli bir kapakla kapalı 0.2 mL test tüpüne yerleştirin. Bir parça modelleme kili ile sabitleyerek tüpün yerinde kaldığından emin olun.
      8. Sistemi dengelemek için numune toplamadan pompayı 2 μL/dk'da 60 dakika boyunca çalıştırmaya devam edin (sıfır numune).
      9. Başlangıç koşulları altında (normal Ringer çözeltisi ile perfüzyon) 5 ardışık 30 dakikalık diyalizat örneği (60 μL ilgili hacim) toplayın. Numuneleri buz üzerinde saklayın.
      10. Sıvının pompadan hayvanın kafasına geçmesi için geçen süreyi hesaplayın (bu, borunun ölü hacmine, yani hava kabarcığı süresine bağlıdır) ve normal Ringer solüsyonu içeren şırıngalardan giden FEP tüpünü şu anda pompayı durdurmadan modifiye (100 mM K ⁺) Ringer solüsyonu içeren şırıngalara geçirin. Sistemde hava kabarcığı olup olmadığını kontrol edin. Pompayı 10 dakika çalıştırın. DİKKAT: 10 dakikalık yüksek K ⁺ stimülasyonunda, hayvanlar kendilerini çılgınca hareket ettirme eğilimindedir ve genellikle çok sayıda ıslak köpek sarsıntısı (kontrol ve nöbet dışı küme hayvanları) veya davranışsal nöbetler (epileptik hayvanlar) gösterir, bu nedenle boruları ve kabloları bükülmeye karşı korumak için müdahale etmeye hazır olun.
      11. 10 dakika sonra, 100 mM K ⁺ Ringer solüsyonu içeren şırıngalardan hortumu normal Ringer solüsyonuna geçirin ve pompanın çalışmasına izin verin. Çözelti değişimleri sırasında pompayı kapatmayın, böylece hatta bağlanacak borunun ucunda bir damla sıvı olacaktır.
      12. Diyalizatın yüksek potasyum içerdiği andan itibaren, yani beşinci dengeleme sonrası diyalizatın toplanmasından sonra, diyalizat fraksiyonlarını 1 saat boyunca her 10 dakikada bir (20 μL) toplayın. 3 ek 30 dakikalık diyalizat örneği toplayın ve pompayı durdurun. Numuneleri buz üzerinde saklayın.
      13. Deneyden sonra numuneleri -80 °C'de Yüksek performanslı sıvı kromatografisi (HPLC) analizine kadar saklayın.
      14. SE'den 24 saat sonra veya ilk spontan nöbetten sonraki 24 saat içinde sadece bir mikrodiyaliz seansının gerçekleştiği akut (24 saat) ve ilk nöbet grubu hariç, mikrodiyaliz deneyini art arda 3 gün boyunca tekrarlayın (Şekil 3).

Sonuçlar

Figure 1. İmplante edilecek cihazın adım adım hazırlanması.(A) Cihazı monte etmek için gerekli olan soldaki koruyucu kılıfında 10 cm uzunluğunda topraklama elektrotu ve sağda mikrodiyaliz için kılavuz kanül bulunan 3 kanallı elektrot. (B). Çıplak elek...

Malzemeler

Bu makalede kullanılan malzemelerin listesi

Ad	Şirket	Katalog numarası	Yorumlar
3 kanallı iki bükümlü elektrot	Invivo1, Plastic One, Roanoke, Virginia, ABD	MS333/3-B/SPC	Material
guide kanül	Agn Tho's, Lindigö, İsveç	MAB 4.15.IC	Malzeme
Reçine KK2 Plastik	Elettra Sport, Lecco, İtalya	KK2	Malzeme
Süper Saldırı jeli Loctite	Henkel Italia Srl, Milano, İtalya	2047420_71941	Material
Imalgene-Ketamine	Merial, Toulouse, Fransa	221300288 (AIC)	Solution
Xylazine	Sigma, Milano, İtalya	X1251	Material
Isoflurane-Vet	Merial, Toulouse, Fransa	103120022 (AIC)	Solution
Altadol 50 mg / ml - tramadol	Formevet, Milano, İtalya	103703017 (AIC)	Solution
Gentalyn 0.1% crm - gentamycine	MSD Italia, Roma, İtalya	20891077 (AIC)	Malzeme
simpleks hızlı diş çimentosu	Kemdent, Associated Dental Products Ltd, Swindon, Birleşik Krallık	ACR811	Malzeme
GlasIonomer CX-Plus Çimento	Shofu, Kyoto, Japonya	PN1167	Malzeme
prob klipsi tutucu	Agn Tho's, Lindigö, İsveç	p/n 100 5001	Equipment
Histoacryl® Blue Topical Skin Adhesive	TissueSeal, Ann Arbor, Michigan, ABD	TS1050044FP	Material
Valium 10 mg/2 ml - diazepam	Roche, Monza, İtalya	019995063 (AIC)	Material
1 mL şırınga with 25G iğne	Vetrotecnica, Padova, İtalya	3	Material
sıçan esnek besleme iğnesi 17G	Agn Tho's, Lindigö İsveç	7206	Malzeme
Çim Teknolojisi cihazı	Grass Technologies, Natus Neurology Incorporated, Pleasanton, California, ABD	M665G08	Ekipmanları (AS40 amplifikatörü, kafa kutusu, ara bağlantı kabloları, telefaktör modeli RPSA S40)
modüler veri toplama ve analiz sistemi MP150	Biopac, Goleta, California, ABD	MP150WSW	Equipment
digital video gözetim sistemi	AverMedia Technologies, Fremont, California, ABD	V4.7.0041FD	Equipment
mikrodiyaliz probu	Agn Tho's, Lindigö İsveç	MAB 4.15.1.Cu	Material
mikrodiyaliz probu	Synaptech, Colorado Springs, Colorado, ABD	S-8010	Malzeme
blok ısıtıcı	Grant Instruments, Cambridge, İngiltere	QBD2	Equipment
karıştırıcı	Cecchinato A, Aparecchi Scientifici, Mestre, İtalya	711	Equipment
infüzyon pompası	Univentor, Zejtun, Malta	864	Equipment
ince delikli polietilen boru	Smiths Medical International Ltd., Keene, New Hampshire, ABD	800/100/100/100	Malzeme
mavi boru adaptörleri	Agn Tho's, Lindigö İsveç	1002	Malzeme
kırmızı boru adaptörleri	Agn Tho's, Lindigö İsveç	1003	Malzeme
22G iğneli 2,5 mL şırınga	Chemil, Padova, İtalya	S02G22	Malzeme
flakon kapağı	Cronus, Labicom, Olomouc, Çek Cumhuriyeti	VCA-1004TB-100	Malzeme
septum	Thermo Scientific, Rockwoood, Tennessee, ABD	Ulusal C4013-60 8 mm TEF/SIL septum	Malzeme
alt yaylı cam uç	Supelco, Sigma, Milano, İtalya	27400-U	Material
otomatik numune alma cihazı şişesi	National Scientific, Thermo Fisher Scientific, Monza, İtalya	C4013-2	Material
Smartline manager 5000 sistem kontrolörü ve degazör ünitesi	Knauer, Berlin, Almanya	V7602	Equipment
Smartline 1000 dördüncül gradyan pompası	Knauer, Berlin, Almanya	V7603	Equipment
mM cinsinden zil çözeltisi	bileşimi: MgCl2 0.85, KCl 2.7, NaCl 148, CaCl2 1.2, %0.3 BSA		Çözümü
mM cinsinden modifiye Ringer çözeltisi	bileşimi: MgCl2 0.85, KCl 100, NaCl 50.7, CaCl2 1.2, %0.3 BSA		Çözeltisi
tuzlu	0.9 NaCl, ph 7.0'a ayarlanmış		Solution
sakaroz çözeltisi	Damıtılmış suda %10 sükroz	Çözelti

%