Fare Beyin Dokusunun Donarak Kırılmış Bir Örneğinde Nöronal Membran Proteinlerinin İmmünoetiketlenmesi

Özet

Kaynak: Schönherr, S., et. al. Fare Amigdalasındaki Glutamat Reseptörlerinin Girişe Özgü Düzenlemesini İncelemek için Kombine Optogenetik ve Donma Kırığı Replika İmmün Etiketleme. J. Vis. Uzm. (2016)

Bu video, elektron mikroskobu için fare beyin dokusunun donarak kırılmış kopyalarının immüno-etiketlemesini göstermektedir. Kırılmış ve kaplanmış kopyalar, reseptörleri açığa çıkarmak için sindirilir. Primer ve altın etiketli sekonder antikorlar, spesifik nöronal membran reseptörlerini etiketlemek için eklenir. Kopya bir ızgaraya monte edilir ve bir elektron mikroskobu altında görselleştirilir.

Protokol

Hayvan örneklerini içeren tüm prosedürler, uygun hayvan etik inceleme komitesi tarafından gözden geçirilmiş ve onaylanmıştır.

1. Numune Hazırlama

1. Beyin fiksasyonu
   1. Fiksatif
      1. 1 L fiksatif için 10 g paraformaldehit tartın ve 300 ml deiyonize suya (H₂O) ekleyin. Sürekli karıştırarak ~ 10 dakika boyunca 55 - 60 ºC'ye ısıtın.
      2. Isıyı kapatın ve 7-8 damla 4 N Sodyum Hidroksit (NaOH) ekleyin. Çözelti ~ 10 dakika içinde netleşmelidir.
      3. Oda sıcaklığına veya RT'ye soğumaya bırakın, 150 ml doymuş bir Pirik asit çözeltisi ekleyin ve deiyonize H₂O ile 500 ml'ye getirin.
      4. 500 ml 0.2 M fosfat tamponu (PB) ekleyin. Filtre kağıdı ile filtreleyin. NaOH ile pH'ı 7.4'e ayarlayın.
      5. Sabitleyiciyi 6 ºC'ye soğutun ve 6 ºC'de bir günden fazla olmamak üzere koyu cam şişelerde saklayın.
   2. Transkardiyak perfüzyon
      1. Fareleri intraperitoneal tiyopental enjeksiyonu (120 mg / kg vücut ağırlığı) ile uyuşturun. Olmaması gereken pedal çekme refleksini kontrol ederek hayvanın derin anestezi altında olduğundan emin olun. Hayvanı, dört ekstremitesi bağlı olacak şekilde bir perfüzyon masasına sırt üstü yerleştirin.
      2. Karın duvarını künt uçlu makasla uzunlamasına açın ve diyaframı ortaya çıkarmak için göğüs kafesinin kaudal sınırı boyunca yanal olarak iki ek kesi yapın. Diyaframı kesin ve göğüs duvarını her iki taraftaki osteokıkırdak sınırda kesin. Kalbi açığa çıkarmak için sternumu içeren torasik duvarın merkezi levhasının kuyruk ucunu kaldırın.
      3. Perikardımı çıkarın ve perfüzyon aparatının kanülünü kabul etmek için sol ventrikülün ucunda küçük, hassas bir kesim yapın. İç çapı 0,6 mm olan künt bir kanül kullanın. Kanülü, ucu çıkan aortun içine görünene kadar ventrikülden nazikçe geçirin ve kanülü bir kelepçe ile sabitleyin. Kanın ve perfüzatların kan dolaşımından çıkmasına izin vermek için sağ atriyumda bir kesi yapın.
      4. Fareleri önce fosfat tampon salin veya PBS (25 mM,% 0.9 sodyum klorür veya NaCl, pH 7.4) ile yaklaşık 1 dakika boyunca 5 ml / dk akış hızında peristaltik bir pompa kullanarak transkardiyal olarak perfüze edin, ardından 7 dakika boyunca buzla soğutulmuş fiksatif uygulayın.
      5. Sabitlemeden sonra, fare kafasını bir makasla kesin ve ardından cildi orta hattan boyundan buruna kadar kesin. Kafatasını tamamen ortaya çıkarmak için kası çıkarın.
      6. Keskin bir makas kullanarak, foramen magnumdan başlayarak oksipital ve interparietal kemikler boyunca uzunlamasına bir kesim yapın. İnce cımbız kullanarak, tüm beyinciği ortaya çıkarmak için bu kemikleri çıkarın. Daha sonra parietal ve frontal kemiklerden burun kemiğine kadar uzunlamasına bir kesi daha yapın ve tüm beyni ortaya çıkarmak için cımbızla çıkarın.
      7. Bir spatula kullanarak beyni zarar vermeden çıkarın ve buz gibi 0,1 M PB'ye koyun.
2. Örneklerin kesitlenmesi ve kırpılması
   1. İlgilenilen alanı içeren jiletle yaklaşık 5 - 6 mm'lik bir koronal blok kesin. Bir siyanoakrilat yapıştırıcı ile vibrodilimleyicinin tutucusuna yapıştırın. Doku bloğunu, neokorteks titreşimli bıçağa bakacak şekilde yönlendirin. Amigdala içeren koronal bölümleri vibroslicer (Şekil 1A) ile 140 μm'de buz gibi 0.1 M PB'de dilimleyin ve aynı tamponda 6 oyuklu bir tabakta toplayın.
   2. Bir stereomikroskop altında, ilgilenilen bölgeyi (burada, amigdala veya ITC'nin interkalasyonlu hücre kütlelerinin medio-dorsal parakapsüler kümesi; bkz. Şekil 1B) dilimden çıkarın. Bunu, silikon elastomer ile kaplanmış ve oftalmik bir neşter kullanarak 0,1 M PB ile doldurulmuş bir Petri kabında yapın. Kesilen blokların ara parçanın deliğine (yaklaşık 1.5 mm) oturduğundan emin olun (Şekil 1B).
   3. Kesilmiş blokları gece boyunca 6 ºC'de (O/N) kriyoproteksiyon solüsyonuna (0,1 M PB'de %30 gliserol) taşıyın.

2. Yüksek Basınçlı Dondurma

NOT: Donma-kırılma Replika İmmünolojik Etiketleme (FRIL) 6 temel adımdan oluşur (Şekil 2): 1) Numunenin yüksek basınçla (2.300 - 2.600 bar'da) hızlı donması. 2) Numunenin kırılması. Kırılma düzlemi genellikle donmuş zarların merkezi hidrofobik çekirdeğini takip eder ve onları iki yarım zar yaprakçıklarına böler: protoplazmaya bitişik olan bir yarısı (P-yüzü) ve hücre dışı veya ekzoplazmik boşluğa bitişik olan bir yarısı (E-yüzü). 3) Platin ve karbonun vakumla biriktirilmesiyle numunenin çoğaltılması. 4) Dokunun deterjan sindirimi. 5) İmmünogold etiketleme. 6) Transmisyon elektron mikroskobu kullanılarak replikanın analizi.

1. Bakır taşıyıcıların hazırlanması
   NOT: FRIL prosedürünün ardışık aşamalarından geçmek için numunelerin metal (altın veya bakır) taşıyıcılara monte edilmesi gerekir. Bu taşıyıcılar, kırılma şekline ve kullanılan makinelerin türüne göre boyut ve tasarım olarak farklılık gösterir. Burada, bakır taşıyıcılar (Şekil 1B, E) ve açıldığında donmuş numune boyunca bir çekme kırılması oluşturan menteşeli bir "çift çoğaltma masası" (bkz. Şekil 3B) kullandık (Şekil 2). Bu, kırık numunenin her iki tarafının da tutulmasına ve çoğaltılmasına izin verir.
   1. Bakır taşıyıcıları bir güderi tabakası kullanarak kararma giderici ile cilalayın.
   2. Taşıyıcıları bir cam tencereye yerleştirin ve sonikasyon su banyosunda iyonik olmayan bir deterjanla (pH ~ 1.5) iki kez temizleyin, ardından musluk suyunda ve ardından deiyonize suda iyice yıkayın ve ardından iki kez etanol ile durulayın.
   3. Bakır taşıyıcıları asetonda 15 dakika boyunca sonikleştirin.
   4. Taşıyıcıları kuruması için filtre kağıdına yerleştirin.
   5. Kesilmiş blok (tutma taşıyıcısı) için tutma kuyusu görevi görecek bir bakır taşıyıcıya (Şekil 1C) çift taraflı banttan bir halka takın.
2. Numunenin donması
   NOT: Sıvı nitrojeni dikkatli bir şekilde kullanın ve uygun gözlük takın.
   1. Numuneyi dondurmadan önce yüksek basınçlı dondurma ünitesini (Şekil 1F) en az 1,5 saat açın.
   2. "HAVA ISITICI" düğmesine basarak ısıtmaya başlayın ve 50 dakika pişirin. Hava sıcaklığını 80 °C'ye ayarlayın.
   3. Nitrojen tankını yüksek basınçlı dondurma ünitesine bağlayın ve Dewar'ın içini sıvı nitrojenle doldurmak için "NITROJEN" düğmesine basın. "AZOT SEVİYESİ" lambası yanar. "Soğutma" düğmesine basarak soğutmaya başlayın.
   4. "NITROJEN SEVİYESİ" söndüğünde "DRIVE IN" düğmesine basın. Hidrolik sistemin pistonu 3 kez ileri geri hareket ettirdiğini kontrol edin.
   5. "AUTO" düğmesine ve "NITROJEN" düğmesine basın. "READY" yandığı anda, yüksek basınçlı dondurma ünitesi yüksek basınçlı dondurma için hazırdır.
   Bir
   6. cam pipet içinde eritilmiş bir platin tel halka kullanarak çift taraflı bandın (Şekil 1B) deliğine kesilmiş bir blok yerleştirin.
   7. Filtre kağıdı veya bir fırça kullanarak kriyoprotektan solüsyonun fazlalığını alın.
      NOT: Bu prosedür, doku çevresinde oluşabilecek ve doku şeklinin ve/veya üst yapısının bozulmasına neden olabilecek hava kabarcıklarının giderilmesi için de önemlidir.
   8. Bir stereomikroskop altında, tutma taşıyıcısını başka bir taşıyıcıyla örtün, böylece doku bloğu iki taşıyıcı arasına sıkıştırılır.
   9. Taşıyıcı sandviçi yüksek basınçlı dondurma ünitesinin numune tutucusuna yerleştirin (Şekil 1D). Numune tutucuyu yüksek basınçlı dondurma ünitesine (uç aşağı) yerleştirin ve numune tutucuyu vidalayarak sabitleyin.
   10. "Jet-Auto" düğmesine basarak dondurma döngüsünü başlatın. Mümkün olduğunca çabuk çalışarak, numune tutucuyu çıkarın ve ucu sıvı nitrojen ile yalıtılmış bir kutuya daldırın. Soğutmak için iki çift forsepsin uçlarını sıvı nitrojene batırın.
   11. Taşıyıcı sandviçi numune tutucusundan dikkatlice çıkarın ve önceden soğutulmuş bir kriyovial içine yerleştirin. Taşıyıcıların yalnızca sıvı nitrojen soğutmalı forsepslerle kullanıldığından emin olun. Nitrojenin flakondan dışarı akmasına izin vermek için kriyoviyaller delinmelidir (Şekil 1G).
   12. İstenen tüm numuneler donana kadar 2.2.6 ila 2.2.11 arasındaki adımları tekrarlayın. Aynı tip numuneyi içeren birden fazla taşıyıcı sandviç aynı şişede saklanabilir.
   13. Taşıyıcıları içeren kriyoviyalleri replikasyona kadar bir kriyotankta saklayın (Şekil 1H).

3. Donma-Kırılma ve Replikasyon

1. Elektron ışını tabancalarının hazırlanması
   1. Elektron ışını tabancalarını yerleştirmeden önce, "deflektör plakası" ile kalkanı çıkarın. Filamanı alt katot kapağından pens aynasına ortalamak için "ayar göstergesini" yerleştirin.
      NOT: Ayar göstergesinin daha büyük çaplı ucu karbon tabancası için kullanılırken, daha küçük çaplı uç platin tabanca içindir.
   2. Yeni filamenti, "basınç laminaları" filamentin uçlarını sıkıştırana kadar göstergenin üzerine kaydırın ve filament bobininin belirli bir açıda uzanmamasını sağlayın.
   3. Ayar göstergesini çıkarın ve karbon çubuğu yerleştirin. Evaporatör çubuk tutucusunun pens aynasını sıkarak, çubuğun ucunun yüksekliğinin alttan ikinci bobinin ortasında olduğundan emin olarak sabitleyin. Platin tabancası için, platin çubuğun ucunun yüksekliği, üstten ikinci filament bobinin ortasında olmalıdır.
   4. Deflektör plakasını değiştirin ve tabancaları dondurma kırma ünitesine yerleştirin. Kullandıktan sonra tabancaları kum püskürtücü ile temizleyin.
2. Donma-kırılma ünitesinin kurulumu
   1. MAINS'i 3'e çevirerek donma kırılma ünitesini (Şekil 1A) açın. Donma-kırılma ve replikasyon prosedürlerinin ayrıntılı bir açıklaması için, üretici tarafından sağlanan çalıştırma talimatlarına bakın.
   2. Donma-kırılma cihazını soğutmadan önce, ünitenin tüm soğutma sistemini ılık hava ile pişirin. MTC 010 cihazındaki (sıcaklık kontrol ünitesi) (Şekil 3A) "Çözdürme" düğmesine basın ve pişirme işleminin 45 dakika çalışmasına izin verin.
   3. Vakum istasyonunu etkinleştirin. Donma-kırılma ünitesi genellikle ~^10-6 - ^10-7 mbar vakum aralığında çalışır.
   4. Azot tankını doldurun ve donma kırma ünitesine bağlayın. Valf tutucunun kuru olduğunu kontrol edin ve ayrıca valf tutucuyu yerleştirmeden önce tankın girişini temizleyin (nem, vakumu ve tankın N₂ dolum göstergesini etkileyebilir).
   5. Sıcaklığı -115 °C'ye ayarlayarak soğutmaya başlayın. Soğutma yaklaşık 45 dakika sürer.
   6. Elektron ışını tabancalarını yerleştirin ve buharlaşma için aşağıdaki parametrelere ulaşmak için akım ve voltajı ayarlayın:
      Karbon tabancası: dönüş açık, konum 90°, karbon birikim hızı 0,1 - 0,2 nm/sn
      Karbon-platin tabanca: dönüş kapalı, konum 60°, birikim hızı 0,06 - 0,1 nm/sn
      NOT: Karbon veya platin çubuk değiştirildikten sonra ilk kez bir tabanca kullanılıyorsa, Kullanmadan önce 3 dakika gazdan arındırın.

3. Kırılma ve çoğaltma

   1. Donmuş taşıyıcı sandviçleri çift çoğaltma tablosuna yerleştirin ve tüm manipülasyonların sıvı nitrojen içinde yapıldığından emin olun.
   2. Çift replika tablayı bir Dewar kabına aktarın ve 45°'lik bir açıyla numune tablası alıcısına sabitleyin. Sıvı nitrojen seviyesi her zaman çift çoğaltma tablasının üzerinde olmalıdır.
   3. Masa manipülatörü ile çift replika masayı alın ve soğuk tabla üzerine donma kırma ünitesine yerleştirin. Çift çoğaltma tablasının sıcaklığının -20 °C'ye ayarlanması için yaklaşık 115 dakika bekleyin.
   4. Vakumun ^10-6 mbar'ın altında ve sıcaklığın -115 °C olduğunu kontrol edin.
   5. Çift çoğaltma masasının üzerine yerleştirilen örtüye bağlı tekerleği saat yönünün tersine manuel olarak döndürerek dokuyu kırın. Kefen döndüğünde, çift kopya masayı açılmaya zorlar ve dokuyu kırar.
   6. Donma-kırılma ünitesinin EVM 030 cihazındaki (elektron ışını buharlaşma kontrol ünitesi) "Yüksek gerilim" düğmesine basın (Şekil 3A).
   7. Kırık dokunun açıkta kalan yüzeylerini (Şekil 3C), 90 ° 'lik bir açıyla 5 nm kalınlığa yerleştirilmiş bir elektron ışını tabancası vasıtasıyla karbonun buharlaştırılması (dönen) ve ardından 60 ° 'lik bir açıyla platin-karbon ile 2 nm kalınlığa kadar tek yönlü bir gölgeleme ile çoğaltın. Son olarak, 90°'lik bir açıyla (dönerek) 15 nm kalınlığında bir karbon tabakası uygulayın.
   8. Buharlaşma için aşağıdaki parametreleri kullanın:
      1. karbon: dönüş açık, konum 90°; hız 0,1 - 0,2 nm/sn; 5 nm
      2. karbon-platin: konum 60°; hız 0,06 - 0,1 nm/sn; 2 nm
      3. karbon: dönüş açık, konum 90°; hız 0,3 - 0,5 nm/sn; 15 nm
   9. Çoğaltılan örnekleri donma kırılma ünitesinden çıkarın ve bunları TBS ( Tris tamponlu tuzlu su, pH 7.4).
   10. Bir platin halkalı filmaşin kullanarak, çoğaltılmış dokuyu numune taşıyıcıdan çıkarın (Şekil 4A).
   11. Tüm örnekler çoğaltılana kadar 3.3.1 ile 3.3.10 arasındaki adımları tekrarlayın.

   4. Replikanın SDS-sindirimi

   1. Replikayı, 1 ml SDS-sindirim tamponu (%2,5 Sodyum Lauril Sülfat, 15 mM Tris'te %20 sakaroz, pH 8,3) ile doldurulmuş 4 ml'lik bir cam şişeye aktarın. 80 °C'de çalkalanarak (45 vuruş/dk) 18 saat sindirin.
   2. Replikaları SDS-sindirim tamponu ile doldurulmuş yeni bir tüpe aktarın ve RT'de saklayın.

4. Immunolabeling

NOT: Antikorlarla yapılan inkübasyonlar dışında tüm inkübasyonlar RT'de hafif çalkalama ile gerçekleştirilir.

1. Kopyayı taze sodyum dodesil sülfat (SDS) - sindirim tamponunda 10 dakika yıkayın.
2. Replikayı bir kez Tris-Tamponlu Salin veya TBS'de% 2.5 BSA (sığır serum albümini) ile 5 dakika ve daha sonra TBS'de% 0.1 BSA ile 3 x 10 dakika yıkayın.
3. TBS'de spesifik olmayan bağlanma bölgelerini 1 saat boyunca% 5 BSA ile bloke edin.
4. % 2 BSA-TBS'de seyreltilmiş birincil antikorları uygulayın. İnkübasyonları 30 μl'lik bir damlada (Şekil 4B) nemli bir odada 15 ° C'de 72 saat boyunca gerçekleştirin (Şekil 4C).
   1. Bu çalışma için, kırık dokudan her iki kopyayı da işleyin. Bir replikayı, tüm α-Amino-3-hidroksi-5-metil-4-izoksazolepropiyonik Asit Reseptörü veya AMPA-R alt birimleri için ortak olan fare GluR1'in 717 - 754 amino asitlerine karşı yükseltilmiş bir kobay poliklonal antikoru ile inkübe edin (seyreltme: 1:200) veya N-Metil-D-Aspartat Reseptörünün veya NMDA-R'nin NR1 alt biriminin 660 - 811 amino asitlerini kaplayan bir rekombinant füzyon proteinine karşı yükseltilmiş bir fare monoklonal antikoru (seyreltme: 1:500) ve yeşil floresan proteinine karşı yükseltilmiş bir tavşan poliklonal antikoru (seyreltme: 1:300).
   2. Diğer replikayı, sıçan μ-opioid reseptörünün 384 - 398 amino asitlerine karşılık gelen sentetik bir peptide karşı yükseltilmiş bir tavşan poliklonal antikoru ile inkübe edin (seyreltme: 1:500).
5. TBS'de% 0.05 BSA (3 x 5 dakika) ile yıkayın.
6. İkincil antikorları uygulayın. Bu çalışma için, TBS'de% 2 BSA ile seyreltilmiş altın (iyonotropik glutamat reseptörleri için 5 nm, μ-opioid reseptörleri için 10 ve / veya Channelrhodopsin-2 Sarı Floresan Proteini veya ChR2-YFP için 15 nm) konjuge antikorlar kullanın. İkincil antikorları 1:30 oranında seyreltin ve 15 ° C O / N'de 30 μl'lik bir damla halinde inkübe edin.
7. RT'de% 0.05 BSA-TBS'de 3 x 5 dakika yıkayın.
8. Ultra saf suda 2 x 5 dakika yıkayın.
9. Replikayı formvar kaplı 100 satırlık paralel çubuk ızgarasına monte edin (Şekil 4D).

Sonuçlar

Şekil 1. Doku Hazırlama ve Yüksek Basınçlı Dondurma. (A) Vibroslicer, dokuyu bölümlere ayırmak için kullanılır. (B) Sonuçta amigdala içeren bir koronal fare beyni bölümü, çift taraflı banttan bir halka ile ...

Malzemeler

Bu makalede kullanılan malzemelerin listesi

Ad	Şirket	Katalog numarası	Yorumlar
Doku hazırlama
Paraformalaldehyde EM grade	Agar Scientific Ltd., Birleşik Krallık<
Doymuş pikrik asit çözeltisi	Sigma-Aldrich, USA	P6744-1GA
Na2HPO4-2H20	Merck Millipore, Germany	1065860500
NaH2PO4-2H2O	Merck Millipore, Germany	1063451000
NaCl	Merck Millipore, Almanya	1064041000
4N NaOH	Carl Roth, Germany	T198.1
Thiopental	Sandoz, Austria	5,133
Glycerol	Sigma-Aldrich, USA	G5516-500ML
GenPure ultra saf su sistemi	Thermo Fisher Scientific, USA	50131235
Peristaltic pump	ISMATEC, Almanya	ISM 930C
Filter Paper	MACHEREY-NAGEL, Germany	MN 615 1/4
Vibroslicer, VT1000S	Leica Microsystems, Austria
Oftalmik neşter	Alcon Laboratories, USA
Perfüzyon kanül	Vieweg, Almanya<
Yüksek basınçlı dondurma
Copper carriers	Engineering Office M. Wohlwend, CH	528
Sidol Lehçe	Henkel, Germany
Chamois skin	Ev gereçleri mağazası
Delgeç, 1,5mm	Stubai, Avusturya
Denatural ethanol	Donauchem, Avusturya
Acetone	Roth, Germany	9372.5
Yüksek Basınçlı Dondurma Makinesi HPM 010	BalTec, CH; şimdi Leica Microsystems	HPM010
Stereo-microscope	Olympus, Japan	SZX10
Sıvı nitrojen
Cryo-flaonlar	Roth, Germany	E309.1
CryoCane	Nalge Nunc International,USA	5015-0001
CryoSleeve	Nalge Nunc International,USA	5016-0001
Sıvı nitrojen depolama kabı	Cryopal, Fransa	GT38
Noniyonik deterjan (Lavocid)	Werner & Mertz Professional, Germany
Freeze-fracture and Replication
Sandblaster, Mikromat 200-1	JOKE Joisten & Kettenbaum, Germany<
Siliciumcarbid SIC 360, tane boyutu 25 - 21μ	JOKE Joisten & Kettenbaum, Germany	955932
Freeze Fracture System BAF 060	BalTec, CH; now Leica Microsystems	BAF060
Ceramic 12 oyuklu plaka	Gröpel, Avusturya	14511
Trizma base	SIGMA, USA	T1503
Trizma hydrochloride	SIGMA, USA	T3253
Sodium chloride	Merck, Almanya	1,06,40,41.000
SDS, Sodyum lauril sülfat	Roth, Germany	5136.1
Sucrose	Merck, Germany	1,07,68,71,000
TRIS	Roth, Almanya	5429.3
Universal Hybridization Oven	Binder, Germany<
Immunolabelling
BSA	SIGMA, USA	A9647
Anti-GFP Antikor	Molecular Probes, USA	A11122
Anti-pan-AMPAR Antikor	Frontier Institute, Japan	pan AMPAR-GP-Af580-1
Anti-NMDAR1 Antikoru, klon 54.1	Merck Millipore, Germany	MAB363
Opioid Receptor-Mu (MOR) Anticor	ImmunoStar, USA	24216
EM keçi anti-kobay, 5nm; ikincil antikor	BBInternational,	EM. GAG5
EM keçi anti-tavşan, 15nm; ikincil antikor	BBInternational,<
Eşek anti-tavşan, 10nm, ikincil antikor	AURION, Hollanda	DAR 10nm
Copper grids, 100 Parallel Bar	Agar scientific, UK	G2012C
Incubator	Major Science, USA	MO-RC
Pioloform Powder	Agar scientific, UK	R1275
Chloroform	Roth, Germany	3313.1

td style='width:153pt;'>AGR1018td style='width:153pt;'>F560088-1td style='width:153pt;'>SANDURET 2- Ktd style='width:153pt;'>7001-0050td style='width:153pt;'>EM. GAR15