ALS Fare Modelinde Eşzamanlı Pletismografi ve Elektromiyografi Kaydı

Özet

Kaynak: Jensen, V. N., et al. Nöromüsküler Hastalığın Fare Modellerinde Solunum Kası Aktivitesi ve Ventilasyonun Tekrarlanan Ölçümü. J. Vis. Uzm. (2017).

Bu video, serbestçe hareket eden bir ALS fare modelinde eşzamanlı pletismografi ve elektromiyografi sinyallerini kaydetme yöntemini göstermektedir. Prosedür, ALS faresindeki aksesuar kasların rolünü araştırmak için solunum modellerini izlemek için bir pletismografi odasının yanı sıra kas aktivitesini yakalamak için implante edilmiş elektrotlar ve bir verici kullanmayı içerir.

Protokol

Hayvan modellerini içeren tüm prosedürler, yerel kurumsal hayvan bakım komitesi ve JoVE veteriner inceleme kurulu tarafından gözden geçirilmiştir.

1. Fareyi Ameliyata Hazırlama

1. İmplantasyon için istenen fareyi seçin (yani, SOD1(G93A) veya kontrol) ve hayvanı tartın.
   NOT: Bu ameliyatı geçiren bir fare (erkek veya dişi) için önerilen yaş ve ağırlık sırasıyla P56 - P120 ve ≥ 24 g'dır.
2. Fareyi 2 L/dk oksijen akış hızıyla %3,5 izofluran altında uyuşturun. Farenin tamamen uyuşturulduğundan emin olmak için bir ayak parmağı çimdikleme ve bir kuyruk kıstırma yapın.
3. Anestezi uygulandıktan sonra, fareyi damla kutusundan çıkarın ve izofluran seviyesini %1,5'e ve oksijen akış hızını 1 L/dk'ya ayarlayarak bir burun konisi aracılığıyla anesteziyi sürdürün. Anestezinin sürdürüldüğünden emin olmak için bir ayak parmağı çimdikleme ve/veya kuyruk kıstırma yapın.
4. Ameliyat sırasında gözlerin kurumasını önlemek için kayganlaştırıcı oftalmik merhem sürün.
5. Kulak ile omuz arasındaki cerrahi bölgeyi ortaya çıkarmak için fareyi tıraş edin (Şekil 1C).
6. İyileşme sürecinde farenin uçları çekme veya kaşıyarak yaralara neden olma olasılığını azaltmak için ayak tırnaklarını ameliyat bölgesine ipsilateral olarak kırpın.
7. Cerrahi bölgeyi önce dezenfektan ve ardından izopropanol ile dönüşümlü olarak temizleme. 2 kez daha tekrarlayın.

2. Skalen ve Trapez Elektromiyografi (EMG) Aktivitesini Kaydetmek için Telemetri Cihazının

İmplante Edilmesi

1. Hayvanı bir diseksiyon mikroskobunun altına, yan tarafı bir ısıtma yastığını kaplayan steril bir pedin üzerine yerleştirin ve burun konisini bantla yerine sabitleyin. Kalpten kaynaklanan elektrokardiyogram (EKG) sinyalini azaltmak için sağ tarafa implant yapmanın en iyisi olduğunu unutmayın.
   NOT: Düzenli bir solunum hızı ve uygun cerrahi anestezi düzlemini korumak için solunumu izleyin ve gerekirse izofluran seviyelerini ayarlayın.
2. Ön ayağı gövde boyunca ipsilateral ayağa doğru çekin.
   NOT: Bu pozisyon, skapulayı kaudal olarak yer değiştirerek scalene ve trapezius kaslarına cerrahi erişim sağlar.
   1. Künt kavisli forsepsleri alın, ön pençeyi cerrahi bölgeye ipsilateral olarak tutun ve pençeyi yerine bantlayın (Şekil 1C). İşlem süresince pençenin güvenli olduğundan emin olmak için güçlü yapışkan cerrahi bant kullanın.
3. Yeni bir çift cerrahi eldiven giyin. Omuz ve kulak arasında yaklaşık 2 cm uzunluğunda eğik bir kesi yapmak için neşteri kullanın (Şekil 1C'deki kırmızı çizgi).
4. Her iki elinizde bir tane olmak üzere iki #2 laminektomi forseps kullanarak, yağ pedini geri çekin ve sternokleidomastoid ve skalen kaslarını kaplayan fasyayı ortaya çıkarmak için yamuk ve platisma kaslarını ayırın (Şekil 1D ve E).
5. Skalen kaslarını tanımlamak için soluk sternokleidomastoid kası ve frenik siniri yer işareti olarak kullanın. Frenik sinirin skalen kaslarına paralel çalıştığını, sternokleidomastoidin ise daha aşağıda olduğunu unutmayın. Skalen kasları, servikal omurlardan trapez kasının altındaki kaburgalara kadar eğik olarak uzanır. Biyopotansiyel uçlar, frenik sinire bitişik uzanan kas olarak tanımlanabilen anterior skalen kasına yerleştirilecektir (Şekil 1F ve G).
   NOT: Dikkat. Bu alan oldukça vaskülarizedir ve subklavyen arteri kesmekten kaçınmak için özen gösterilmelidir. Frenik sinire ve brakiyal pleksusa zarar vermekten kaçının.
6. Skalen ve trapez kasları tanımlandıktan sonra (Şekil 1G), verici için hayvanın sırtında, kürek kemikleri arasında deri altı bir cep yapın.
   1. Doku ayırma makasını kullanın. Künt uçları derinin hemen altına yerleştirin ve vericinin genişliğinin yaklaşık 1.25 katı bir cep açıklığı oluşana kadar yayın (Şekil 1H).
      NOT: Verici minimum dirençle yerleştirilmelidir, ancak cep, vericinin kendi başına hareket edebileceği kadar büyük olmamalıdır. Cep çok küçükse, verici cilde sürtünerek hayvanın cildi çizmesine ve/veya kurşunu dışarı çekmesine neden olabilecek tahrişe neden olabilir. Cep çok büyükse, seromlar oluşabilir veya verici elverişsiz bir konuma göç edebilir.
7. Ilık, steril tuzlu su ile yıkayın ve vericiyi daha düz tarafı kas olacak şekilde yerleştirin. Vericiyi düz duracak ve teller bükülmüş yerine birbirine paralel olarak cepten çıkacak şekilde konumlandırın (Şekil 1I). Cihazın altındaki fazla kabloyu kıvırın ve düz bir şekilde yatırın.
8. Vericiden gelen skalen ve trapez kaslarına giden uçları çalıştırın, böylece iki bipotansiyel uç seti düz ve birbirine paralel durur.
9. Ön skalenleri çevredeki kaslardan ayırmak için laminektomi forsepslerini kullanın ve skalen kası boyunca kas liflerine dik olan 25 gauge bir iğne sokun.
   1. İğnenin ucuna bir uç yerleştirin ve ardından iğneyi kasın dışına çekin, kas içine sokulan kurşunu telin yalıtımına kadar geride bırakın (Şekil 1J ve K). Hangi renkli uçların hangi kasa yerleştirildiğini kaydedin.
10. Telin açıkta kalan ucuna, kurşunun yerleştirildiği kasın yakınına küçük bir damla siyanoakrilat yapıştırıcı yerleştirin ve kurşun kapağı telin üzerine hızla kaydırın, böylece kurşun kapak ile kas arasında hiçbir tel açığa çıkmaz (Şekil 2A ve B).
    NOT: EMG derivasyonlarını siyanoakrilat ile sabitlemek kabul edilen bir uygulama olsa da, alternatif bir yöntem kurşun kapağın etrafına ipek bir dikiş düğümü atmaktır.
11. Kapağın distalindeki fazla teli kesin ve kurşun kapağın/telin ucuna bir damla siyanoakrilat yapıştırıcı uygulayın. Serbest bırakmadan önce tutkalın polimerize olması için zaman verin (Şekil 2C ve D).
12. Aynı kasın ilkine paralel zıt polarite ucunu ilk derivasyondan 1 - 2 mm uzağa yerleştirmek için aynı adımları (3.10-3.12 adımları) izleyin.
13. 3.10 - 3.12 arasındaki adımları tekrarlayarak skalen kasının hemen önünde bulunan trapezius kasına uçlar yerleştirin (Şekil 1L ve M).
14. Tel uçlarının yerine sabitlendiğinden ve hayvanın vücut hareketlerini çekmeden gerçekleştirmesi için yeterli gevşeklik olduğundan emin olun. Fazla uzunluktaki kurşunun cilde temas etmediğinden emin olun, çünkü bu, hayvanın kurşunu kaşımasına veya çekmesine neden olabilecek tahrişe neden olabilir. Herhangi bir olası rahatsızlığı önlemek için gerekirse kabloları yeniden konumlandırın.
15. Ön ayağı tutan bandı nazikçe çıkarın. Yağ pedini kasın üzerine geri çekin ve yerleştirilen uçları kapatmak için kullanın. Kesi siyanoakrilat yapıştırıcı ile kapatın, cilt kanatlarını tekrar bir araya getirerek kesi aynı hizada olacak şekilde kapatın. Deri fleplerinin bir kısmını kavisli forseps ile birlikte sıkıştırın ve bu çizgi boyunca küçük bir siyanoakrilat yapıştırıcı çizgisi uygulayın.
16. Hayvan hala anestezi altındayken ameliyat sonrası ağrıyı hafifletmek için deri altına 0,1 mL carprofen enjekte edin.
    NOT: Ameliyattan sonraki 1-2 gün boyunca günde bir kez 0,1 mL carprofen uygulamaya devam edin ve bundan sonra gerektiği kadar.
17. Hayvanı burun kemiğinden çıkarın ve uyanık olana ve kafesin etrafında gönüllü olarak hareket edene kadar önceden ısıtılmış kuluçka makinesinde temiz bir kafese koyun. Daha sonra, hayvanı en az 15 dakika kuluçka makinesinde tutun, hareketlerini ve uyanıklığını izleyin.

3. Postoperatif Bakım

1. Ameliyattan sonra ev hayvanları ayrı ayrı. İyileşen hayvanlara diyet jeli ve su şişesi sağlayın.
2. Ameliyattan sonraki ilk 30 dakika boyunca hayvanı izleyin. Ameliyattan sonra 5 saat boyunca en az saatte bir hayvanı kontrol edin. Ameliyattan sonraki günlerde günde en az iki kez kontrol edin.
3. Nekroz, insizyon boyunca ve implantı içeren vücut boşluğu içinde enfeksiyon (yani ısı, şişme ve kızarıklık) ve seroma oluşumuna dikkat edin.
   NOT: Bu belirtiler ameliyattan sonraki ilk hafta içinde ortaya çıkar. Şekil 1N, ameliyattan bir ay sonra sağlıklı, iyileşmiş bir hayvanı göstermektedir. EMG kayıtları implantasyondan hemen sonra yapılabilse de, implantasyondan hemen sonra EKG sinyalleri yüksek olabileceğinden, EMG ve pletismografi kaydedilmeden önce hayvanlara iyileşmeleri için en az bir hafta verilir.

4. Eşzamanlı Elektromiyografi ve Pletismografi Sinyallerini

1. AlmaÖnyargı akışı da dahil olmak üzere tüm alım ekipmanlarını açın.
   NOT: Fareler için akış hızı tipik olarak 1,0 L/dk olarak ayarlanır.
2. Pletismografi odalarını bir akış ölçer kullanarak kalibre edin.
   NOT: Contaların çatlak veya kırık olmadığından emin olmak için pletismografi odalarını periyodik olarak kontrol edin. İyi durumlarını korumak için, lastik contaları haftada bir kez vakumlu gres gibi bir yağlayıcı ile kaplayın.
3. Üretici tarafından belirtildiği gibi verici kalibrasyonunu girin.
4. EMG ve pletismografi kaydetmeden önce fareyi alıştırmak için en az 1 saat pletismografi odasına yerleştirin. Birden fazla oda kullanarak, bir fareden kayıt yaparken bir sonraki fare ikinci bir odaya alışırken kayıt yapmak mümkündür. Pil gücünden tasarruf etmek için alışma süresi boyunca vericiyi açmayın (Şekil 1O).
5. Kayıttan önce (ancak kalibrasyondan sonra), implante edilen hayvanın 1 inç yakınına güçlü bir mıknatıs yerleştirerek vericiyi açın; alıcının önündeki kırmızı ışık, vericinin ne zaman açık olduğunu gösterecektir.
6. "Edinme" etiketli açılır menüyü kullanarak edinmeye başlayın ve "Edinmeyi Başlat"ı seçin. Kayıt süresi deneye göre değişebilse de, tipik bir pletismografi ve EMG kaydı 1 - 3 saat sürer.
   NOT: Vericinin kendine özgü örnekleme hızı 240 Hz'dir. Noktalar arasında enterpolasyon yapmak ve daha yumuşak bir dalga formu sağlamak için yazılımda 500 Hz'lik daha hızlı bir hız ayarlanmıştır. İmplanttaki alçak geçiren filtre (kenar yumuşatma filtresi görevi görür) ve yüksek geçiren filtre, bu telemetri cihazı için 1 ila 50 Hz bant genişliğini belirtir. 60 Hz A / C paraziti, EMG sinyalinde aşırı gürültüye katkıda bulunmaz, çünkü implantlar pille çalışır ve hayvan implantı korur ve elektrik alanlarından yol açar. Pletisismografi, EMG ve video, edinme yazılımı aracılığıyla gerçek zamanlı olarak otomatik olarak senkronize edilir.
7. Alım bittiğinde, vericiyi bir mıknatısla kapatın ve hayvanı hazneden çıkarın.

Sonuçlar

Şekil 1. Solunum Kası EMG'sini Ölçmek İçin Telemetri Cihazının İmplantasyonu. EMG'yi ölçmek için (A) İki çift biyopotansiyel uçlu telemetri vericileri. Uçlar istenen uzunlukta kesilebilir (altta) ...

Malzemeler