Otolog Kan Enjeksiyonu ile Bir Sıçan Modelinde Masif Pontin Kanamasının İndüklenmesi

Özet

Kaynak: Tang, X. et. al., Otolog Kanın İkili Enjeksiyonu ile Masif Pontin Kanaması. J. Vis. Uzm. (2021)

Bu protokol, masif pontin kanamasını modellemek için bir sıçanın beyninin pontin bölgesine otolog kanın kontrollü infüzyonunu tanımlar. Amaç, lokalize basıncı artırarak lokalize bir beyin kanamasını simüle etmektir.

Protokol

Hayvan modellerini içeren tüm prosedürler, yerel kurumsal hayvan bakım komitesi ve JoVE veteriner inceleme kurulu tarafından gözden geçirilmiştir.

1. Animal and instruments
2. 8 haftalık erkek Sprague-Dawley sıçanlarını tartı kullanın 250 ± 10 gr.
3. Ameliyattan en az 7 gün önce fareleri, 25 °C ortam sıcaklığı, %65 bağıl nem ve 12/12 saatlik aydınlık-karanlık döngüsü ile kontrollü çevre koşullarında barındırın.
4. Sınırsız yiyecek ve su sağlayın.
5. Aletleri hazırlayın (Şekil 1A-E).

2. Kanı pons

1. Deneyler için uygun vücut ağırlığına sahip fareleri seçmek için ameliyattan 3 gün önce fareleri tekrar tartın.
2. Modellemeden önceki 3 gün boyunca, normal farelerin denge kirişini duraksamadan geçebilmelerini sağlamak için fareleri günde 3 kez denge kirişi üzerinde yürümeleri için eğitin.
3. Anesteziden önce ısıtma pedini 37 °C'ye ısıtın.
4. Stereotaksik çerçevedeki tutucuya bir mikro matkap takın.
5. Sıçanlara intraperitoneal olarak 50 mg/kg ketamin ve 5 mg/kg ksilazin enjekte edin. Ayak parmağınızı kıstırma tepkisi gelmeyene kadar bekleyin.
6. Fareyi yüzüstü pozisyonda stereotaksik çerçeveye taşıyın. Başı sabitlemek için kulak çubuklarını kulak kanalının üzerine yerleştirin. Enjeksiyonun eğrilmesini önlemek için kafatasını yatay konumda sabitleyin (Şekil 1F).
7. Giriş ve çıkış portu olan stereotaksik bir burun konisi aracılığıyla izofluran (%97.5 oksijen ve %2.5 izofluran) ile anesteziyi koruyun.
8. Korneayı nemli tutmak için göz merhemi kullanın.
9. Mikro tıraş makinesiyle kafatasının üzerindeki saçları tıraş edin.
10. Şekil 1F'de gösterildiği gibi, bilateral lateral kanthus çizgisinden posterior bıngıldağın 0,5 cm arkasına kadar kafatasında bir işaretleyici kalem ile 3 cm'lik bir orta çizgi çizin.
11. Entoiyot cerrahi fırçalamayı, işaretli orta çizginin ortasından başlayıp dışa doğru dönerek dairesel bir şekilde uygulayın.
12. Cerrahi örtüyü yerleştirin.
13. İşaretli orta çizgi boyunca bir neşterle bir kesi yapın.
14. Olası kanı temizlemek için pamuklu çubuk kullanın.
15. Kafatasını ortaya çıkarmak için kafa derisi kanadının her iki tarafına bir parça forseps yerleştirin (Şekil 1G).
16. Bir pamuklu çubuğu %0,9 tuzlu suya batırın ve bağ dokularının mikro matkaba takılmasını önlemek için bağ dokularını kafatası kemiğinden nazikçe çıkarın.
17. Bregma'nın orta noktasını bir işaretleyici kalemle başlangıç noktası olarak işaretleyin.
18. AP-9.0 mm, Lat 0 mm'de bir mikro matkap kullanarak bir kraniyotomi (1 mm çapında) gerçekleştirin (Şekil 2B ve Tablo 1). Bu nokta venöz sinüse çok yakın olduğu için dikkatli ilerleyin (Şekil 1G).
19. Mikromatkabı stereotaksik çerçeveden çıkarın.
20. Stereotaksik tutucuya 100 μL'lik bir Hamilton şırınga koyun (Şekil 1K). Enjeksiyon pompası anahtarını açın, Hızlı İnhalasyon düğmesine tıklayın, heparin solüsyonunu (100 mL salin içinde seyreltilmiş 12500 U) 100 μL'ye aspire edin ve ardından kanın çok hızlı pıhtılaşmasını önlemek için tamamen boşaltın.
21. Cildi dezenfekte etmek, azgınlığı yumuşatmak ve enjeksiyonun başarı oranını artırmak için kuyruk damarını genişletmek için tüm kuyruğa kökten uca en az 3 kez klorheksidin ve %75 alkol cerrahi ovma uygulayın.
22. 1 mL'lik bir şırıngaya kafa derisi akupunkturu takın.
23. Kafa derisi akupunkturunu kuyruk ucundan 3 cm uzaktaki lateral kuyruk damarına yerleştirin ve 150 μL kan alın (Şekil 1H).
24. Saç derisi akupunkturunu 1 mL şırıngadan çıkarın.
25. Kanı bir tüpe aktarın (Şekil 1I).
    NOT: Kanın pıhtılaşmasını önlemek için hızlı bir şekilde aktarın.
26. Cerrahi eldivenleri değiştirin.
27. Çekme modunu seçin, hacmi 100 μL'ye ayarlayın, hızı 200 μL/dk'ya ayarlayın, RUN düğmesine tıklayın ve Hamilton şırıngasına 100 μL kan aspire edin (Şekil 1J).
28. Demleme modunu seçin ve hızı 1 μL/dk olarak ayarlayın.
29. Şırıngayı, ucu beyin yüzeyinin 9,2 mm altına ulaşana kadar ilerletin (Şekil 2C ve Şekil 1L).
30. İlk 10 μL kanı 1 μL/dk hızında enjekte etmek için Çalıştır düğmesine tıklayın (Tablo 1).
31. Enjeksiyonu durdurun ve kanın subaraknoid boşluğa akmasını önlemek için şırıngayı 20 dakika boyunca yerinde bırakın.
32. Ucu beyin yüzeyinin 9,0 mm altına gelene kadar şırıngayı geri çekin.
33. Kalan kan tamamen enjekte edilene kadar enjeksiyonu 1 μL/dk ile aynı hızda yeniden başlatın.
34. Kanın geri akışını önlemek için şırıngayı 10 dakika yerinde bırakın.
35. Şırıngayı beyinden yavaşça çıkarın.
36. Kraniotomi deliğini kapatmak için kemik çimentosu kullanın.
37. Çimento kuruduğunda, yarayı 4-0 poliamid sütür filamenti ile dikin. 3 veya 4 dikiş diktikten sonra 2-1-1 standart cerrahi düğüm atın.
38. Enfeksiyonu önlemek için, sıçana intraperitoneal olarak penisilin (0.25 mL, 4 mL salin içinde seyreltilmiş 80 IU) enjekte edin.
39. Sıçanlara Butorphanol tartrat (2.5 mg / kg) ile deri altına enjekte edin ve ameliyattan 24 saat sonrasına kadar ameliyat sonrası ağrıyı hafifletmek için enjeksiyonu her 2 saatte bir tekrarlayın.
40. Anesteziden tamamen iyileşene kadar fareyi her 15 dakikada bir gözlemleyin. Kafesin altında bir ısıtma yastığı bulunan orijinal kafese geri koyun. Kurban edilene kadar farenin yiyecek ve suya ücretsiz erişimini sağlayın.

Tablo 1: Otolog kan enjeksiyonu.

AP -9.0 mm; Enlem 0; Vert -9,2 mm<

AP -9.0 mm; Enlem 0; Vert -9.0 mm

	Mild	Orta	Massive
Total volume	30 μL	60 μL	100 μL
First injection
Stereotaktik koordinatlar	AP -9.0 mm; Enlem 0; Vert -9,2 mm
Volume	10 μL	10 μL	10 μL
Speed	1 μL/min	1 μL/dk	1 μL/min
interval time	20 dk	20 min	20 dk
Second injection
Stereotactic coordinates
Volume	20 μL	50 μL	90 μL
Speed	1 μL/min	1 μL/dk	1 μL/min
İğnenin çekilmesinden önce	10 min	10 min	10 min
AP: ön-arka konum
Lat: lateral
Vert: vertical

<='td style='border:0.625pt solid #1a202c;padding:4pt 2pt;vertical-align:top;' colspan='2'>td style='border:0.625pt solid #1a202c;padding:4pt 2pt;vertical-align:top;'>

Sonuçlar

Şekil 1: Cerrahi aletler ve prosedürler. (A) Anestezi makinesi. (B) Cerrahi aletler. (C) Mikro matkap. (D) Mikro enjeksiyon pompası. (E) Stereotaksik cihaz. (F) Kafatasının ortasında bir çizgi işaretlenmiştir. (G) Sarı ok, matkap konumunu gösterir. (H) Kuyruk damarından kan tahliyesi. (I) Kanı Eppendorf tüpüne aktarın. (J) Kanı bir...

Malzemeler

Bu makalede kullanılan malzemelerin listesi

Ad	Şirket	Katalog numarası	Yorumlar
100ml Tuzlu çözelti	Guangdong yixiang	191222201 C1	Heparin disuent
100μl Microinjector	Shanghai Gaoge		Otolog kan
1ml Şırınga	Jiangsu Zhiyu	20191014	Kuyruk damarından
75% Alcohol	Shandong Lierkang		Fare kuyruğunun
Yapışkan bant	Shanghai Jinzhong		Cerrahi aletler
Hayvan anestezi sistemi	RWD	R510-31S-6	Anesteziyi indükleme ve sürdürme
Balance beam	Jiangsu Saiangsi
Nörolojik defisit skorları için
Bone cement	Shanghai Xinshiji	20180306	Cerrahi aletler
Butorphanol tartrate	Jiangsu Hengrui		For pain management
Elektrikli kraniyal matkap	Nanjing Darwin biotechnology	20180090018	Kafatasında
EP tube	Nantong Surui		Otolog kanı transfer
Eritromisin göz kremi	Yunnan pharmacy		Göz koruması
Heating pad	Dangerous Jungle	JR01	Sıcak tutmak
Heparin sodyum enjeksiyonu	Chengdu Haitong Pharmacal Company	190701	Heparin seyreltici hazırlanıyor
IndoPhors	Guoyao of China		Sterilizasyon
Isoflurane	RWD	20080701	Anesteziyi
Micro-injection pump	Baoding Leifu	TFD03-01-C	Otolog kan
İğne tutucu	Shanghai Jinzhong	J32020	Surgicl instruments
Penicilin	Guoyao of China		Enfeksiyon Önleme
Q-tips	Jiangxi Songhe		Surgicl instruments
Scalp needle	Jiangxi Hongda	20200313	Kuyruk damarından
Scalpel	Shanghai Kaiyuan	170902	Surgicl instruments
Kesme makası	Shanghai Jinzhong	Y00040	Surgicl instruments
Stereotaksik apparatus	RWD	900-00001-00	Cerrahi konumlandırma
Cerrahi havlu	Xinxiang Huakangweicai	20070601	Surgicl instruments
Sütür iğnesi	Shanghai Jinzhong		Surgicl instruments
Sütür makası	Shanghai Jinzhong	J25041	Surgicl instruments
Doku tutma forseps	Shanghai Jinzhong	J31080	Cerrahi aletler

enjeksiyonu otolog kanı çekin dezenfeksiyonuçapak deliği açmaindükleme ve sürdürmeenjeksiyonu otolog kan çekin için