Oksijen-Glukoz Yoksunluğu ve Reoksijenasyonun Hücre-Hücre Etkileşimleri Üzerine Etkisi

Özet

Kaynak: Alluri, H., et.al. Kan-beyin bariyeri disfonksiyonunu incelemek için in vitro iskemi-reperfüzyon hasarı modeli olarak oksijen-glikoz yoksunluğu ve reoksijenasyon. J. Vis. Uzm. (2015).

Video, hipoksik ve besin yoksunluğundan yoksun koşulları simüle ederek oksijen-glikoz yoksunluğunun ve ardından yeniden oksijenasyonun sıçan beyni mikrovasküler endotel hücreleri (RBMEC'ler) üzerindeki etkisini göstermektedir. Bu koşullar, ATP'nin tükenmesine, hücre içi kalsiyumun artmasına ve hücre bağlantı proteinlerini bozan ve stres lifi oluşumunu indükleyen, böylece hücre-hücre etkileşimlerini zayıflatan reaktif oksijen türlerinin (ROS) oluşumuna neden olur.

Protokol

1. Endotel Hücrelerinin Tohumlanması

1. Yetişkin Sprague Dawley sıçanlarından RBMEC'lerin birincil kültürlerini elde edin (veya ticari olarak elde edin).

2. RBMEC'leri, sıçan beyni endotel hücresi büyüme ortamını kullanarak 100 cm fibronektin (50 μg / ml) kaplı petri kaplarında yetiştirin. Birleşme noktasına ulaşılana kadar ortamı iki günde bir değiştirin.

3. % 80-90 birleşme noktasına ulaşıldığında, hücreleri 5 ml fosfat tamponlu salin (PBS) içinde döndürerek nazikçe yıkayın. Hücreler daha sonra 37 °C'ye dengelenmiş, 1 ml ılık %0.25 tripsin-etilendiamintetraasetik asit (EDTA) çözeltisine maruz bırakılarak ayrılır.

4. Hücreleri 37 °C'de 2-5 dakika, hücreler ayrılıp dağılana kadar inkübe edin. NOT: Hücreleri ayırmak için kültür kabına dokunun. Hücrelerin yemeğin yüzeyinden tamamen ayrıldığını doğrulamak için hücreleri mikroskop altında görüntüleyin.

5. Tripsini nötralize etmek için petri kabına 5 ml tam ortam ekleyin. Ayrılmış hücreler içeren ortamı pipetleyin ve 15 ml'lik bir santrifüj tüpüne toplayın.

6. Endotel hücreleri içeren ortamı 220 x g'da 5 dakika santrifüjleyin.

7. Süpernatanı aspire edin ve pelet içeren hücreleri koruyun. Peletleri bir pipetle hafifçe yukarı ve aşağı karıştırarak 3-5 ml taze sıçan beyin endotel hücresi büyüme ortamına süspanse edin. Hücreler daha sonra otomatik hücre sayacı veya bir hemositometre kullanılarak sayılacaktır.

8. Hücre süspansiyonunu, kuyucuk başına 10.000-15.000 hücre arasında değişen bir tohumlama yoğunluğuna sahip fibronektin (50 μg / ml) önceden kaplanmış 8 oyuklu steril hazneli slayt sistemine, 0.7 sq. cm / kuyuya aktarın. Birleşme sağlanana kadar hücreleri 37 °C'de büyütün NOT: Western blots veya diğer deneylerin yapılması için hücreler, deneyin gerektirdiği şekilde 10 cm'lik hücre kültürü kaplarında veya özel kaplarda büyütülebilir.

2. Oksijen ve Glukoz Deprivasyonu-Reoksijenasyon İn Vitro Model

1. OGD-R'nin RBMEC'ler üzerindeki etkilerini incelemek için hipoksi hücre kültürü sistemini kullanın (bkz. Şekil 1). Deneye başlamadan önce hipoksi hücre kültürü sistemini üreticinin talimatlarına göre kurun ve kalibre edin.

2. Birleşim odası kızaklarını (adım 1.8) 37 °C inkübatörden çıkarın. Hazne slaytındaki tüm ortamı oksijeni alınmış, glikozsuz, Dulbecco'nun Modifiye Kartal Ortamı (DMEM) ile değiştirin ve OGD durumunu temsil etmek için 37 ° C'de 2 saat boyunca% 95 nitrojen ve% 5 karbondioksit ile hipoksi odasına yerleştirin.

3. Hücreleri 37 ° C'de% 95 oksijen,% 5 karbondioksit ile inkübatöre geri taşıyın ve taze sıçan beyin endotel hücresi tam ortamı ile sağlayın ve 37 ° C'de 1 saat daha inkübe edin.

NOT: Bu adım bir yeniden oksijenasyon durumunu temsil eder.

Sonuçlar

Malzemeler

Bu makalede kullanılan malzemelerin listesi

Ad	Şirket	Katalog numarası	Yorumlar
Proox model 110	Biospherix	Model 110
DMEM, glikoz yok	Gibco, Yaşam teknolojileri	11966-025
Rhodamine Phalloidin	Life technologies	R415
ZO-1 Tavşan Poliklonal Antikor	Yaşam teknolojileri	617300
Nunc Lab Tek II-CC 8 iyi steril, cam slaytlar	Termo bilimsel	177402
FITC-etiketli anti-tavşan ikincil antikor	Santa cruz	sc-2090
DPBS 1X	Thermo scientific	SH 30028.03	Mevcut diğer PBS'ler şunlar olabilir